目的:胰島素抵抗(IR)是指機體靶組織,主要為骨骼肌、脂肪等外周組織對葡萄糖攝取和利用障礙,是2型糖尿病(T2DM)發(fā)病的重要機制。其中骨骼肌是利用葡萄糖和維持血糖平衡的重要組織,葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)是骨骼肌葡萄糖糖代謝的主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運體,其蛋白表達(dá)、轉(zhuǎn)位和活性與胰島素抵抗密切相關(guān),p38MAPK信號通路通過調(diào)節(jié)GLUT4活性和轉(zhuǎn)位在胰島素抵抗發(fā)生中起重要作用。黃連素(Berberine,BBR),屬于異喹啉類生物堿,多存于毛茛科黃連屬植物,已有的研究表明它其具有多種藥理學(xué)活性,如抗腸道細(xì)菌感染、抗心律失常、促進(jìn)胰島素的分泌、改善胰島素抵抗等,其中改善IR與其調(diào)節(jié)GLUT4蛋白表達(dá)與活性有關(guān),但具體作用機制還不清楚。本課題以T2DM小鼠和小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12模型為研究對象,采用分子對接模擬等方法研究BBR是否通過干預(yù)p38MAPK信號通路調(diào)節(jié)GLUT4的蛋白表達(dá)與活性,從而改善IR,本研究將進(jìn)一步闡明BBR改善IR的作用機制,為防治T2DM提供更好的實驗依據(jù)。方法:1.BBR干預(yù)骨骼肌C2C12細(xì)胞葡萄糖代謝的研究構(gòu)建小鼠C2C12骨骼肌細(xì)胞系,給予不同濃度的BBR(0.25,0.5,1μmol·L~(-1))干預(yù)。葡萄糖氧化酶法檢測細(xì)胞葡萄糖消耗;2-NBDG法檢測細(xì)胞葡萄糖攝取;分子對接模擬預(yù)測BBR與Insulin Receptor(InsR)、GLUT1、GLUT4蛋白對接效果;Western blot檢測InsR-β、GLUT1、GLUT4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的情況;免疫熒光檢測GLUT4的表達(dá)和轉(zhuǎn)位。2.BBR干預(yù)高脂飼料加STZ誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠骨骼肌葡萄糖代謝的研究選擇高脂飼料加STZ腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病胰島素抵抗小鼠模型。造模成功后的隨機分6組,即模型組、陽性對照組、BBR低、中、高劑量組、BBR中劑量配伍肉桂醛(10:1)組。正常對照組和模型組給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,陽性對照組給予吡格列酮。灌胃給藥6周,檢測小鼠的空腹血糖(FBG fasting blood glucose)、血清胰島素水平(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。結(jié)果:1.C2C12細(xì)胞實驗結(jié)果表明(1)C2C12誘導(dǎo)分化成功:C2C12成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4~5天,細(xì)胞形態(tài)逐漸變長,80%以上的成肌細(xì)胞可分化成多核的骨骼肌細(xì)胞。與未分化的相比,分化4天的骨骼肌細(xì)胞標(biāo)志性蛋白myogenin表達(dá)明顯升高,表明誘導(dǎo)分化成功,可用于后續(xù)實驗。(2)BBR在2.5μmol·L~(-1)以下的濃度無細(xì)胞毒性:0、2.5、10、40μmol·L~(-1)濃度的BBR干預(yù)分化前后的C2C12細(xì)胞24h,發(fā)現(xiàn)BBR濃度為40μmol·L~(-1)時,對分化前的細(xì)胞活性沒有明顯影響;濃度為2.5μmol·L~(-1)時,對分化后的細(xì)胞活性沒有明顯影響;濃度為10、40μmol·L~(-1)時,分化后的細(xì)胞形態(tài)改變明顯,因此認(rèn)為BBR濃度在2.5μmol·L~(-1)以下的濃度對細(xì)胞沒有毒性。(3)BBR對C2C12糖代謝影響:葡萄糖氧化酶法、2-NBDG法檢測顯示0.25、0.5、1μmol·L~(-1)濃度的BBR干預(yù)16h的骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗量、葡萄糖攝取顯著增加,說明BBR能促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞糖代謝。(4)BBR對GLUT4分子對接模擬結(jié)果:BBR與GLUT4產(chǎn)生π-π鍵相互作用,同時與Insulin Receptor、GLUT1可以結(jié)合產(chǎn)生氫鍵作用,說明BBR可能有很好的活性;BBR與Insulin Receptor、GLUT1、GLUT4對接打分分別為-5.370、-8.117、-7.274,說明BBR能夠與GLUT1、GLUT4結(jié)合。(5)BBR對GLUT4及p38MAPK的磷酸化水平的影響:研究發(fā)現(xiàn)BBR抑制了InsR-β的表達(dá),對GLUT1、GLUT4蛋白表達(dá)沒有影響,但可以刺激GLUT4從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜,同時BBR增加了p38MAPK的磷酸化水平。2.在體動物實驗結(jié)果表明(1)造模組C57BL/6J小鼠喂養(yǎng)45%高脂飼料8周后,腹腔注射STZ120mg/kg,72h后測小鼠FBG,以FBG≧11.1mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)篩選出45只T2DM小鼠模型,分成6組用于后續(xù)實驗。(2)黃連素能夠降低T2DM小鼠的血糖、血清胰島素水平,改善胰島素抵抗,而且黃連素配伍肉桂醛的降糖效果優(yōu)于黃連素單獨給藥。結(jié)論:1.BBR可以促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞糖代謝,刺激GLUT4從細(xì)胞核向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位,可能通過抑制InsR-β的表達(dá)、提高p38MAPK磷酸化水平實現(xiàn)的。2.BBR可以改善T2DM小鼠的胰島素抵抗,配伍肉桂醛后作用更強。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

黃連素通過 p38MAPK 調(diào)節(jié)骨骼肌葡萄糖代謝的機制研究三、實驗結(jié)果（一）C2C12 骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)及分化為了驗證 C2C12 成肌細(xì)胞分化成骨骼肌細(xì)胞，并且能夠用于后續(xù)的實驗，本研究采用了實時動態(tài)監(jiān)測成像拍照觀察期其形態(tài)學(xué)變化以及Western Blot法檢測 0 天和分化 4 天后 C2C12 細(xì)胞中肌細(xì)胞生成素 myogenin[57]的蛋白表達(dá)情況。實時動態(tài)監(jiān)測成像結(jié)果表明，C2C12 成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化 0 天，細(xì)胞形態(tài)為星型或者多邊形，換成誘導(dǎo)分化液培養(yǎng)后，細(xì)胞之間相互融合，細(xì)胞形態(tài)由原來的星型或者多邊形逐漸變成圓形，隨著分化時間延長，逐漸出現(xiàn)短條狀的肌管，分化 4 天后 80%以上的成肌細(xì)胞可分化成長條狀、多核的骨骼肌細(xì)胞（見圖 1-1 A、B）。Western blot 結(jié)果表明，myogenin 在未分化的 C2C12 成肌細(xì)胞中基本未表達(dá)，誘導(dǎo)分化 4 天后，骨骼肌細(xì)胞中 myogenin 表達(dá)明顯升高，表明誘導(dǎo)分化成功，可用于后續(xù)實驗（見圖 1-1 C）。

廣州中醫(yī)藥大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)位論文實時動態(tài)檢測成像拍照結(jié)果表明，用 0、2.5、10、40μmol·L-1濃度的黃連素干預(yù)分化前、后的 C2C12 細(xì)胞 24h，黃連素濃度為 0~40μmol·L-1時，分化前的細(xì)胞形態(tài)沒有明顯改變（見圖 1-2A-D）；濃度為 0~2.5μmol·L-1時，分化后的細(xì)胞形態(tài)沒有明顯影響（見圖 1-2 E、F）；但濃度為 10、40μmol·L-1時，分化后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，長條肌管形態(tài)邊界模糊，細(xì)胞核易見（見圖 1-2 G、H）。因此認(rèn)為黃連素濃度在 40μmol·L-1以下對 C2C12 成肌細(xì)胞形態(tài)沒有影響，濃度在 2.5μmol·L-1以下對 C2C12 骨骼肌細(xì)胞形態(tài)沒有影響。

1-3.黃連素對 C2C12 骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗的影響（x±se，n=注：與正常組相比，**P<0.01.1-3 Glucose consumption in C2C12 myotubes（**P<0.01 vs cont連素對骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響測黃連素對正常 C2C12 骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖攝取功能的影響B(tài)DG 法，用實時動態(tài)監(jiān)測儀拍照，檢測黃連素（0.25、0.5、112 骨骼肌細(xì)胞 16h 后，細(xì)胞對葡萄糖的攝取情況。實時動態(tài)，黃連素（0.25、0.5、1μmol·L-1）干預(yù) C2C12 骨骼肌細(xì)胞 1色熒光強度極弱（見圖 1-4A），與正常組相比，0.25、0.5、連素組的綠色熒光強度均有所增強，且 1μmol·L-1時綠色熒光-4 B-D），結(jié)果表明黃連素能夠促進(jìn) C2C12 骨骼肌細(xì)胞對葡萄
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2854727