瘧疾主要是經(jīng)攜帶瘧原蟲的按蚊叮咬后引起的一種高發(fā)病率且對人體的多個器官都具有致病作用的蟲媒傳染病,多發(fā)于非洲及亞熱帶地區(qū)。青蒿素被世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)為世界范圍內(nèi)腦型醫(yī)治瘧疾和惡性瘧疾的首選藥物,但因青蒿素的一些不良藥代動力學(xué)特性以及像氯喹一樣可能出現(xiàn)的耐藥性問題,同時為了提高治愈率,縮短療程,WHO提倡青蒿素聯(lián)合療法(ACT)。但是,黃花蒿中青蒿素含量低、提取流程復(fù)雜,以及ACT中聯(lián)用抗瘧藥價格昂貴,嚴重阻礙了青蒿素類產(chǎn)品在抗瘧劑方面的應(yīng)用。由此,一些科研工作者開始研究黃花蒿植物療法,包括茶劑和干葉口服,也稱為以植物為基礎(chǔ)的ACT療法。研究證明黃花蒿植物中含有多種抗瘧活性成分以及對青蒿素產(chǎn)生增效作用的成分。盡管由于劑量無法控制以及組分復(fù)雜等問題,尚不支持該茶劑用于治療瘧疾,但是在一些瘧疾流行的發(fā)展中國家,茶飲已經(jīng)被用于瘧疾的預(yù)防和治療。但在使用的過程中也發(fā)現(xiàn)了以下問題:單次服用后效果顯著,多次服用之后復(fù)發(fā)快,停用一段時間后再服用又重新具有療效。因此,我們推斷可能是黃花蒿茶劑中存在的多種化學(xué)成分之間產(chǎn)生了代謝性相互作用導(dǎo)致了這種現(xiàn)象的出現(xiàn)。細胞色素P450酶是人體中最主要的藥物代謝酶,此中的CYP3A4和CYP2B6具有較高的誘導(dǎo)性,核受體是含量最豐富的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一,孕烷X受體(PXR)是介導(dǎo)CYP3A4/2B6誘導(dǎo)的主要核受體,組成型雄甾烷受體(CAR)同樣也是。從核受體調(diào)控的角度來考慮代謝性相互作用的機理是十分必要的。本研究采用報告基因法在體外對黃花蒿中經(jīng)PXR和CAR對CYP3A4/2B6產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的組分進行篩選,為以黃花蒿植物為基礎(chǔ)的青蒿素聯(lián)合療法提供部分理論和實驗基礎(chǔ)。綜述如下:1.pGL3-CYP2B6-Luc 質(zhì)粒的構(gòu)建本章根據(jù)相關(guān)文獻完成了 pGL3-CYP2B6-Luc質(zhì)粒的構(gòu)建。首先合成人類CYP2B6的遠端和近端啟動子的序列,隨后插入到pGL3-basic報告基因的上游,得到構(gòu)建好的pGL3-CYP2B6-Luc 質(zhì)粒。2.雙熒光素酶報告基因體系的建立和優(yōu)化本章應(yīng)用上述構(gòu)建好的pGL3-CYP2B6-Luc的報告基因質(zhì)粒以及本實驗室已有的pcDNA3.1(+)-hPXR、pcDNA-hCAR3、pcDNA3.1(+)、pGL3-control、pRL-TK 以及pGL3-CYP3A4-Luc質(zhì)粒,建立了基于hPXR/hCAR3的CYP3A4/2B6的體外報告基因篩選模型。以瞬時轉(zhuǎn)染方式將表達質(zhì)粒、報告基因質(zhì)粒以及內(nèi)參質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進HepG2細胞中,分別以hPXR的經(jīng)典激動劑利福平以及hCAR3的經(jīng)典激動劑CITCO對CYP3A4/2B6的誘導(dǎo)倍數(shù)作為評價指標(biāo),對各個通路進行驗證,并通過優(yōu)化得到各質(zhì)粒的最適比例最終構(gòu)建得到了 4條通路的篩選模型,將其用于黃花蒿提取物的篩選。3.報告基因法研究黃花蒿各部分提取物對hPXR/hCAR3介導(dǎo)的CYP3A4/2B6轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用采取構(gòu)建好的雙熒光素報告基因模型,以DMSO也就是空白溶劑作陰性對照,以對應(yīng)的陽性藥物作陽性對照,黃花蒿提取物刺激細胞48小時后進行雙熒光素酶活性測定,結(jié)果表明,包括50%,85%,Total在內(nèi)的幾個分段提取物均能在不同程度上通過PXRwt誘導(dǎo)CYP3A4的表達,PE以及EtoAc的提取物也有較強的激活效應(yīng),同時,粗提物基質(zhì)量的多少也會對這種激活效應(yīng)產(chǎn)生影響。此外,對單體化合物的進一步篩選發(fā)現(xiàn)Arteannuin A具有較強的激活效應(yīng),Arteannuin B僅表現(xiàn)出微弱的激活作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn),Arteannuin A和Arteannuin B通過PXR的五種突變體對CYP3A4/2B6的誘導(dǎo)作用是不同的,說明PXR的基因多態(tài)性影響了 PXR對CYP3A4/2B6的這種調(diào)控作用。此外,基于CAR的CYP3A4/2B6研究發(fā)現(xiàn),Arteannuin A和Arteannuin B也可以在一定程度上激活CAR,從而對CYP3A4/2B6產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。4.蛋白、基因水平以及計算機模擬對Arteannuin A與Arteannuin B的驗證通過分別檢測CYP3A4/2B6的基因表達、蛋白表達來驗證Arteannuin A與Arteannuin B是否能夠誘導(dǎo)CYP3A4/2B6。藥物處理HepG2細胞48h,提取細胞蛋白與RNA,按操作進行Western blot與real-time PCR檢測CYP3A4/2B6的蛋白及基因表達量變化。結(jié)果顯示,Arteannuin A和Arteannuin B對CYP3A4/2B6產(chǎn)生了程度不同的誘導(dǎo)作用,與報告基因的結(jié)果類似。分子對接結(jié)果表明,Arteannuin A和Arteannuin B均能夠容納在PXR/CAR LBD的配體結(jié)合腔內(nèi),氫鍵以及疏水性作用力的差別可能是造成二者激活效應(yīng)不同的原因。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號說明
第一章 前言
    1 瘧疾治療現(xiàn)狀
        1.1 青蒿素與青蒿素聯(lián)合療法
        1.2 以植物為基礎(chǔ)的青蒿素聯(lián)合療法
    2 藥物代謝酶與核受體
        2.1 藥物代謝性相互作用
        2.2 細胞色素P450氧化酶與青蒿素類藥物
        2.3 核受體與青蒿素類藥物
        2.4 核受體與藥物代謝酶的基因多態(tài)性
    3 酶誘導(dǎo)作用的評價
        3.1 評價方法
        3.2 報告基因方法
    4 本研究的主要內(nèi)容與意義
第二章 CYP2B6報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建與報告基因模型的建立
    1 實驗材料
        1.1 試藥
        1.2 材料
        1.3 儀器設(shè)備
        1.4 試劑配制
    2 實驗方法
        2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
            2.1.1 瓊脂糖凝膠電泳
            2.1.2 載體酶切
            2.1.3 目的片段的獲取
            2.1.4 將PCR的產(chǎn)物與載體交換
            2.1.5 轉(zhuǎn)化
            2.1.6 重組質(zhì)粒的鑒定
            2.1.7 菌液活化與質(zhì)粒提取
            2.1.8 質(zhì)粒的雙酶切
        2.2 報告基因模型的構(gòu)建
            2.2.1 HepG2細胞處理
            2.2.2 質(zhì)粒的獲取
            2.2.3 瞬時轉(zhuǎn)染
            2.2.4 雙熒光素酶活性測定
            2.2.5 基于hPXR/hCAR3的CYP3A4/2B6報告基因模型的驗證
            2.2.6 基于hPXR-CYP3A4報告基因模型的優(yōu)化
    3 實驗結(jié)果與討論
        3.1 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果
            3.1.1 載體酶切結(jié)果
            3.1.2 目的片段PCR結(jié)果
            3.1.3 重組質(zhì)粒的鑒定
            3.1.4 重組質(zhì)粒的雙酶切
        3.2 報告基因模型的構(gòu)建結(jié)果
            3.2.1 質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳
            3.2.2 基于hPXR/hCAR的CYP3A4/2B6報告基因模型的驗證結(jié)果
            3.2.3 基于hPXR-CYP3A4報告基因模型的優(yōu)化
    4 本章小結(jié)
第三章 黃花蒿提取物對hPXR/hCAR介導(dǎo)的CYP3A4/2B6轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用
    1 實驗材料
        1.1 試藥
        1.2 材料
        1.3 儀器設(shè)備
        1.4 試劑配制
    2 實驗方法
        2.1 HepG2細胞處理
        2.2 質(zhì)粒的獲取
        2.3 瞬時轉(zhuǎn)染
        2.4 雙熒光素酶活性測定
        2.5 雙熒光素酶報告基因法對黃花蒿粗提物與單體化合物進行篩選
    3 實驗結(jié)果與討論
        3.1 黃花蒿提取物對hPXRwt介導(dǎo)的CYP3A4的調(diào)控作用
            3.1.1 青蒿素對hPXRwt介導(dǎo)的CYP3A4的調(diào)控作用
            3.1.2 黃花蒿分段粗提物對hPXRwt介導(dǎo)的CYP3A4的調(diào)控作用
            3.1.3 黃花蒿EtoAc/PE提取物對hPXRwt介導(dǎo)的CYP3A4的調(diào)控作用
            3.1.4 黃花蒿單體化合物對hPXRwt介導(dǎo)的CYP3A4的調(diào)控作用
        3.2 Arteannuin A/B對hPXRwt及其突變體介導(dǎo)的CYP3A4/2B6的調(diào)控作用
        3.3 Arteannuin A/B對hCAR3介導(dǎo)的CYP3A4/2B6的調(diào)控作用
    4 本章小結(jié)
第四章 Arteannuin A與Arteannuin B對CYP3A4/2B6誘導(dǎo)的驗證
    1 實驗材料
        1.1 試藥
        1.2 材料
        1.3 儀器設(shè)備
        1.4 試劑配制
    2 實驗方法
        2.1 HepG2細胞處理
        2.2 質(zhì)粒的獲取
        2.3 熒光定量PCR檢測
        2.4 Western blot檢測
        2.5 計算機模擬分子對接
    3 實驗結(jié)果與討論
        3.1 熒光定量PCR對Arteannuin A和Arteannuin B的測定結(jié)果
            3.1.1 轉(zhuǎn)染PXRwt的測定結(jié)果
            3.1.2 轉(zhuǎn)染PXR158的測定結(jié)果
            3.1.3 轉(zhuǎn)染PXR163的測定結(jié)果
            3.1.4 轉(zhuǎn)染PXR370的測定結(jié)果
            3.1.5 轉(zhuǎn)染PXR379的測定結(jié)果
            3.1.6 轉(zhuǎn)染PXR403的測定結(jié)果
            3.1.7 轉(zhuǎn)染CAR3的測定結(jié)果
        3.2 Western blot對Arteannuin A/B的測定結(jié)果
        3.3 分子對接結(jié)果
    4 本章小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻
致謝
附錄
攻讀學(xué)位期間的學(xué)術(shù)成果
學(xué)位論文評閱及答辯情況表

【參考文獻】

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本文編號：2854710