瘧疾主要是經(jīng)攜帶瘧原蟲(chóng)的按蚊叮咬后引起的一種高發(fā)病率且對(duì)人體的多個(gè)器官都具有致病作用的蟲(chóng)媒傳染病,多發(fā)于非洲及亞熱帶地區(qū)。青蒿素被世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)為世界范圍內(nèi)腦型醫(yī)治瘧疾和惡性瘧疾的首選藥物,但因青蒿素的一些不良藥代動(dòng)力學(xué)特性以及像氯喹一樣可能出現(xiàn)的耐藥性問(wèn)題,同時(shí)為了提高治愈率,縮短療程,WHO提倡青蒿素聯(lián)合療法(ACT)。但是,黃花蒿中青蒿素含量低、提取流程復(fù)雜,以及ACT中聯(lián)用抗瘧藥價(jià)格昂貴,嚴(yán)重阻礙了青蒿素類產(chǎn)品在抗瘧劑方面的應(yīng)用。由此,一些科研工作者開(kāi)始研究黃花蒿植物療法,包括茶劑和干葉口服,也稱為以植物為基礎(chǔ)的ACT療法。研究證明黃花蒿植物中含有多種抗瘧活性成分以及對(duì)青蒿素產(chǎn)生增效作用的成分。盡管由于劑量無(wú)法控制以及組分復(fù)雜等問(wèn)題,尚不支持該茶劑用于治療瘧疾,但是在一些瘧疾流行的發(fā)展中國(guó)家,茶飲已經(jīng)被用于瘧疾的預(yù)防和治療。但在使用的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了以下問(wèn)題:單次服用后效果顯著,多次服用之后復(fù)發(fā)快,停用一段時(shí)間后再服用又重新具有療效。因此,我們推斷可能是黃花蒿茶劑中存在的多種化學(xué)成分之間產(chǎn)生了代謝性相互作用導(dǎo)致了這種現(xiàn)象的出現(xiàn)。細(xì)胞色素P450酶是人體中最主要的藥物代謝酶,此中的CYP3A4和CYP2B6具有較高的誘導(dǎo)性,核受體是含量最豐富的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一,孕烷X受體(PXR)是介導(dǎo)CYP3A4/2B6誘導(dǎo)的主要核受體,組成型雄甾烷受體(CAR)同樣也是。從核受體調(diào)控的角度來(lái)考慮代謝性相互作用的機(jī)理是十分必要的。本研究采用報(bào)告基因法在體外對(duì)黃花蒿中經(jīng)PXR和CAR對(duì)CYP3A4/2B6產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的組分進(jìn)行篩選,為以黃花蒿植物為基礎(chǔ)的青蒿素聯(lián)合療法提供部分理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。綜述如下:1.pGL3-CYP2B6-Luc 質(zhì)粒的構(gòu)建本章根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)完成了 pGL3-CYP2B6-Luc質(zhì)粒的構(gòu)建。首先合成人類CYP2B6的遠(yuǎn)端和近端啟動(dòng)子的序列,隨后插入到pGL3-basic報(bào)告基因的上游,得到構(gòu)建好的pGL3-CYP2B6-Luc 質(zhì)粒。2.雙熒光素酶報(bào)告基因體系的建立和優(yōu)化本章應(yīng)用上述構(gòu)建好的pGL3-CYP2B6-Luc的報(bào)告基因質(zhì)粒以及本實(shí)驗(yàn)室已有的pcDNA3.1(+)-hPXR、pcDNA-hCAR3、pcDNA3.1(+)、pGL3-control、pRL-TK 以及pGL3-CYP3A4-Luc質(zhì)粒,建立了基于hPXR/hCAR3的CYP3A4/2B6的體外報(bào)告基因篩選模型。以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方式將表達(dá)質(zhì)粒、報(bào)告基因質(zhì)粒以及內(nèi)參質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG2細(xì)胞中,分別以hPXR的經(jīng)典激動(dòng)劑利福平以及hCAR3的經(jīng)典激動(dòng)劑CITCO對(duì)CYP3A4/2B6的誘導(dǎo)倍數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)各個(gè)通路進(jìn)行驗(yàn)證,并通過(guò)優(yōu)化得到各質(zhì)粒的最適比例最終構(gòu)建得到了 4條通路的篩選模型,將其用于黃花蒿提取物的篩選。3.報(bào)告基因法研究黃花蒿各部分提取物對(duì)hPXR/hCAR3介導(dǎo)的CYP3A4/2B6轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用采取構(gòu)建好的雙熒光素報(bào)告基因模型,以DMSO也就是空白溶劑作陰性對(duì)照,以對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性藥物作陽(yáng)性對(duì)照,黃花蒿提取物刺激細(xì)胞48小時(shí)后進(jìn)行雙熒光素酶活性測(cè)定,結(jié)果表明,包括50%,85%,Total在內(nèi)的幾個(gè)分段提取物均能在不同程度上通過(guò)PXRwt誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá),PE以及EtoAc的提取物也有較強(qiáng)的激活效應(yīng),同時(shí),粗提物基質(zhì)量的多少也會(huì)對(duì)這種激活效應(yīng)產(chǎn)生影響。此外,對(duì)單體化合物的進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)Arteannuin A具有較強(qiáng)的激活效應(yīng),Arteannuin B僅表現(xiàn)出微弱的激活作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),Arteannuin A和Arteannuin B通過(guò)PXR的五種突變體對(duì)CYP3A4/2B6的誘導(dǎo)作用是不同的,說(shuō)明PXR的基因多態(tài)性影響了 PXR對(duì)CYP3A4/2B6的這種調(diào)控作用。此外,基于CAR的CYP3A4/2B6研究發(fā)現(xiàn),Arteannuin A和Arteannuin B也可以在一定程度上激活CAR,從而對(duì)CYP3A4/2B6產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。4.蛋白、基因水平以及計(jì)算機(jī)模擬對(duì)Arteannuin A與Arteannuin B的驗(yàn)證通過(guò)分別檢測(cè)CYP3A4/2B6的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)來(lái)驗(yàn)證Arteannuin A與Arteannuin B是否能夠誘導(dǎo)CYP3A4/2B6。藥物處理HepG2細(xì)胞48h,提取細(xì)胞蛋白與RNA,按操作進(jìn)行Western blot與real-time PCR檢測(cè)CYP3A4/2B6的蛋白及基因表達(dá)量變化。結(jié)果顯示,Arteannuin A和Arteannuin B對(duì)CYP3A4/2B6產(chǎn)生了程度不同的誘導(dǎo)作用,與報(bào)告基因的結(jié)果類似。分子對(duì)接結(jié)果表明,Arteannuin A和Arteannuin B均能夠容納在PXR/CAR LBD的配體結(jié)合腔內(nèi),氫鍵以及疏水性作用力的差別可能是造成二者激活效應(yīng)不同的原因。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號(hào)說(shuō)明
第一章 前言
    1 瘧疾治療現(xiàn)狀
        1.1 青蒿素與青蒿素聯(lián)合療法
        1.2 以植物為基礎(chǔ)的青蒿素聯(lián)合療法
    2 藥物代謝酶與核受體
        2.1 藥物代謝性相互作用
        2.2 細(xì)胞色素P450氧化酶與青蒿素類藥物
        2.3 核受體與青蒿素類藥物
        2.4 核受體與藥物代謝酶的基因多態(tài)性
    3 酶誘導(dǎo)作用的評(píng)價(jià)
        3.1 評(píng)價(jià)方法
        3.2 報(bào)告基因方法
    4 本研究的主要內(nèi)容與意義
第二章 CYP2B6報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建與報(bào)告基因模型的建立
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 試藥
        1.2 材料
        1.3 儀器設(shè)備
        1.4 試劑配制
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
            2.1.1 瓊脂糖凝膠電泳
            2.1.2 載體酶切
            2.1.3 目的片段的獲取
            2.1.4 將PCR的產(chǎn)物與載體交換
            2.1.5 轉(zhuǎn)化
            2.1.6 重組質(zhì)粒的鑒定
            2.1.7 菌液活化與質(zhì)粒提取
            2.1.8 質(zhì)粒的雙酶切
        2.2 報(bào)告基因模型的構(gòu)建
            2.2.1 HepG2細(xì)胞處理
            2.2.2 質(zhì)粒的獲取
            2.2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
            2.2.4 雙熒光素酶活性測(cè)定
            2.2.5 基于hPXR/hCAR3的CYP3A4/2B6報(bào)告基因模型的驗(yàn)證
            2.2.6 基于hPXR-CYP3A4報(bào)告基因模型的優(yōu)化
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.1 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果
            3.1.1 載體酶切結(jié)果
            3.1.2 目的片段PCR結(jié)果
            3.1.3 重組質(zhì)粒的鑒定
            3.1.4 重組質(zhì)粒的雙酶切
        3.2 報(bào)告基因模型的構(gòu)建結(jié)果
            3.2.1 質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳
            3.2.2 基于hPXR/hCAR的CYP3A4/2B6報(bào)告基因模型的驗(yàn)證結(jié)果
            3.2.3 基于hPXR-CYP3A4報(bào)告基因模型的優(yōu)化
    4 本章小結(jié)
第三章 黃花蒿提取物對(duì)hPXR/hCAR介導(dǎo)的CYP3A4/2B6轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 試藥
        1.2 材料
        1.3 儀器設(shè)備
        1.4 試劑配制
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 HepG2細(xì)胞處理
        2.2 質(zhì)粒的獲取
        2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        2.4 雙熒光素酶活性測(cè)定
        2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因法對(duì)黃花蒿粗提物與單體化合物進(jìn)行篩選
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.1 黃花蒿提取物對(duì)hPXRwt介導(dǎo)的CYP3A4的調(diào)控作用
            3.1.1 青蒿素對(duì)hPXRwt介導(dǎo)的CYP3A4的調(diào)控作用
            3.1.2 黃花蒿分段粗提物對(duì)hPXRwt介導(dǎo)的CYP3A4的調(diào)控作用
            3.1.3 黃花蒿EtoAc/PE提取物對(duì)hPXRwt介導(dǎo)的CYP3A4的調(diào)控作用
            3.1.4 黃花蒿單體化合物對(duì)hPXRwt介導(dǎo)的CYP3A4的調(diào)控作用
        3.2 Arteannuin A/B對(duì)hPXRwt及其突變體介導(dǎo)的CYP3A4/2B6的調(diào)控作用
        3.3 Arteannuin A/B對(duì)hCAR3介導(dǎo)的CYP3A4/2B6的調(diào)控作用
    4 本章小結(jié)
第四章 Arteannuin A與Arteannuin B對(duì)CYP3A4/2B6誘導(dǎo)的驗(yàn)證
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 試藥
        1.2 材料
        1.3 儀器設(shè)備
        1.4 試劑配制
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 HepG2細(xì)胞處理
        2.2 質(zhì)粒的獲取
        2.3 熒光定量PCR檢測(cè)
        2.4 Western blot檢測(cè)
        2.5 計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.1 熒光定量PCR對(duì)Arteannuin A和Arteannuin B的測(cè)定結(jié)果
            3.1.1 轉(zhuǎn)染PXRwt的測(cè)定結(jié)果
            3.1.2 轉(zhuǎn)染PXR158的測(cè)定結(jié)果
            3.1.3 轉(zhuǎn)染PXR163的測(cè)定結(jié)果
            3.1.4 轉(zhuǎn)染PXR370的測(cè)定結(jié)果
            3.1.5 轉(zhuǎn)染PXR379的測(cè)定結(jié)果
            3.1.6 轉(zhuǎn)染PXR403的測(cè)定結(jié)果
            3.1.7 轉(zhuǎn)染CAR3的測(cè)定結(jié)果
        3.2 Western blot對(duì)Arteannuin A/B的測(cè)定結(jié)果
        3.3 分子對(duì)接結(jié)果
    4 本章小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
攻讀學(xué)位期間的學(xué)術(shù)成果
學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2854710