第一部分 在腦缺血/再灌注大鼠模型冰片配伍黃芪甲苷與三七總皂苷促進(jìn)藥物成分入腦的研究目的:探討在腦缺血再灌注大鼠模型,冰片是否可以促進(jìn)黃芪甲苷(AST IV)和三七總皂苷(PNS)配伍時主要有效成分透過血腦屏障進(jìn)入腦組織。方法:采用大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)再灌注模型,將大鼠隨機(jī)分為模型組、單用冰片組、單用AST IV組、單用PNS組、AST IV+PNS配伍組、冰片+AST IV+PNS配伍組,以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)測定患側(cè)與健側(cè)大腦皮層、小腦中AST IV和PNS有效成分(Rg1、Rb1、R1)的含量。結(jié)果:AST IV無論是單用還是與PNS、冰片配伍,其口服后主要分布在大腦皮層,尤其是患側(cè)大腦皮層。冰片配伍AST IV+PNS后能使患側(cè)與健側(cè)大腦皮層中AST IV含量顯著增加。PNS單用,其有效成分Rg1、Rb1、R1主要分布在患側(cè)小腦。冰片與AST IV+PNS合用后,能使患側(cè)皮層中Rb1含量顯著增加,使健側(cè)和患側(cè)大腦皮層中Rg1含量增加,使大腦皮層尤其是患側(cè)大腦皮層及小腦中R1含量增加。結(jié)論:大鼠腦缺血再灌注后,AST IV與PNS的有效成分人參皂苷Rb1、Rg1及R1在皮層和小腦均有一定的分布。AST IV單用時,AST IV主要分布在大腦皮層;PNS單用時,有效成分Rb1、Rg1及R1主要分布在小腦。冰片與AST IV、PNS合用后,能促進(jìn)AST IV、Rb1、Rg1及R1向大腦皮層的富集,尤其是向缺血再灌注側(cè)大腦皮層的富集;而且,能不同程度地促進(jìn)AST IV、Rb1、Rg1及R1在大腦皮層和小腦的吸收,尤其是患側(cè)大腦皮層的吸收。第二部分 冰片配伍黃芪甲苷與三七總皂苷對腦缺血再灌注后血腦屏障通透性的影響目的:探討冰片、黃芪甲苷(ASTⅣ)和三七總皂苷(PNS)配伍對腦缺血再灌注后血腦屏障(BBB)通透性的影響和作用機(jī)制。方法:采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,灌胃給藥冰片、ASTⅣ、PNS及其配伍藥物,改良Longa法觀察神經(jīng)功能缺損癥狀,干濕重法測定腦組織含水量,鑭示蹤電鏡技術(shù)反映BBB通透性,免疫組化法和Western-blot法檢測腦組織閉鎖小帶蛋白1(zonula cccludens-1,ZO-1)、ZO-2、咬合蛋白(Occludin)及閉合蛋白5(Claudin-5)表達(dá)。結(jié)果:1、腦缺血再灌注后,大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀,神經(jīng)功能評分顯著增加。各藥物組能顯著降低神經(jīng)功能評分,且冰片+AST IV+PNS組的效應(yīng)強(qiáng)于各藥物單用及ASTⅣ+PNS組。2、腦含水量測定顯示,腦缺血再灌注后,腦含水量顯著增加。各藥物能顯著降低腦含水量,且ASTⅣ+PNS配伍的效應(yīng)強(qiáng)于ASTⅣ與PNS單用,冰片+AST IV+PNS的效應(yīng)強(qiáng)于各藥物單用及ASTⅣ+PNS配伍。3、鑭示蹤電鏡結(jié)果顯示,在正常腦組織,硝酸鑭顆粒呈連續(xù)線性分布在毛細(xì)血管內(nèi)壁,BBB正常;腦缺血再灌注后,BBB緊密連接破壞,鑭顆粒從毛細(xì)血管漏出,腦組織水腫明顯并失去正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。各藥物均能不同程度減輕上述病理改變,緩解BBB結(jié)構(gòu)受損,鑭顆粒漏出減少,腦水腫和腦組織受損程度減輕,尤以冰片+AST IV+PNS效應(yīng)更加明顯。4、免疫組化和Western-blot檢測結(jié)果表明,腦缺血再灌注后,ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin-5蛋白表達(dá)顯著減少。各藥物可使ZO-1蛋白表達(dá)顯著增加;除AST IV外,各藥物顯著上調(diào)Occludin蛋白表達(dá),冰片+AST IV+PNS還能顯著上調(diào)ZO-2蛋白表達(dá);且AST IV+PNS上調(diào)ZO-1、Occludin的效應(yīng)強(qiáng)于AST IV、PNS單用,冰片+AST IV+PNS上調(diào)ZO-1、ZO-2、Occludin的效應(yīng)強(qiáng)于各藥物單用及ASTIV+PNS。結(jié)論:冰片促進(jìn)AST IV及PNS有效成分進(jìn)入腦組織的作用不但不是通過增強(qiáng)BBB通透性、開放BBB來實現(xiàn),而且冰片、AST IV和PNS還能不同程度降低腦缺血再灌注后BBB通透性,減輕腦水腫,對抗腦組織損傷,三種藥物合用可增強(qiáng)效應(yīng),其機(jī)制可能與協(xié)同抑制腦缺血后緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2、Occludin蛋白表達(dá)的下調(diào),從而保護(hù)BBB有關(guān)。第三部分 冰片配伍黃芪甲苷與三七總皂苷對腦缺血再灌注后血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響目的:從血腦屏障(BBB)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)探討冰片配伍黃芪甲苷(ASTⅣ)和三七總皂苷(PNS)對腦缺血再灌注后促進(jìn)藥物成分入腦和抗腦損傷的作用。方法:采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,灌胃給藥冰片、ASTⅣ、PNS及其配伍藥物,2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色法測定腦組織損傷,Western-blot法檢測腦組織外排蛋白P-糖蛋白(P-gp)和多藥耐藥蛋白(MRP)-1、2、4、5及攝取蛋白有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體3(OCT-3)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽2(OATP-2)蛋白的表達(dá),Real-time PCR法檢測腦組織多藥耐藥(MDR)基因mdr1a、mdr1b和mrp-1、mrp-2、mrp-4、mrp-5m RNA含量。結(jié)果:1、TTC染色顯示,腦缺血再灌注后,腦組織出現(xiàn)明顯梗死灶。各藥物能顯著減少腦梗死體積,ASTⅣ+PNS配伍的效應(yīng)強(qiáng)于ASTⅣ與PNS單用,冰片+AST IV+PNS的效應(yīng)強(qiáng)于各藥物單用及ASTⅣ+PNS配伍。2、對主要外排蛋白和相應(yīng)基因檢測結(jié)果表明,腦缺血再灌注后,P-gp、MRP-1、MRP-2、MRP-4、MRP-5蛋白表達(dá)均顯著增多。冰片能顯著下調(diào)P-gp、MRP-2、MRP-4蛋白表達(dá),PNS能顯著下調(diào)MRP-4、MRP-5蛋白水平,AST IV、AST IV+PNS與冰片+AST IV+PNS能顯著下調(diào)P-gp、MRP-2、MRP-4、MRP-5蛋白表達(dá),且冰片+AST IV+PNS的效應(yīng)顯著強(qiáng)于各藥物單用及AST IV+PNS,AST IV+PNS的效應(yīng)顯著強(qiáng)于AST IV或PNS單用。相應(yīng)基因表達(dá)結(jié)果也與蛋白表達(dá)結(jié)果類似。3、對腦組織主要攝取蛋白OCT-3、OATP-2蛋白表達(dá)檢測表明,腦缺血再灌注后OCT-3蛋白表達(dá)在模型組及藥物組變化均不明顯,而模型組OATP-2蛋白顯著降低。PNS、AST IV+PNS及冰片+AST IV+PNS能顯著上調(diào)OATP-2蛋白表達(dá),且AST IV+PNS的效應(yīng)顯著強(qiáng)于AST IV、PNS單用,冰片+AST IV+PNS的效應(yīng)顯著強(qiáng)于各藥物單用及AST IV+PNS。結(jié)論:腦缺血再灌注后,腦組織損傷,BBB的主要外排蛋白和基因表達(dá)均顯著增強(qiáng),而攝取蛋白OATP-2表達(dá)顯著減少。冰片配伍AST IV及PNS后,能增強(qiáng)抗缺血性腦損傷的作用,其作用可能與下調(diào)BBB中外排蛋白P-gp、MRP-2、MRP-4、MRP-5和相應(yīng)基因表達(dá),同時上調(diào)攝取蛋白OATP-2表達(dá),促使腦組織中AST IV及PNS有效成分的吸收與富集,增強(qiáng)腦組織中藥物濃度有關(guān)。
【學(xué)位單位】：湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

通過2.3.1處理空白腦組織，得到空白腦組織樣本，在（1）條件下檢測，Rg1、Rb1、R1、AST IV的保留時間分別為3.52、6.01、3.18、6.38 min，且在Rg1、Rb1、R1、AST IV的保留時間處均無明顯色譜峰干擾（圖1A、1B，圖2A、2B），表明該分析方法具有很好的專屬性。

對照品基質(zhì)溶液中4種有效成分MRM離子對質(zhì)譜圖

通過2.3.1處理空白腦組織，得到空白腦組織樣本，在（1）條件下檢測，Rg1、Rb1、R1、AST IV的保留時間分別為3.52、6.01、3.18、6.38 min，且在Rg1、Rb1、R1、AST IV的保留時間處均無明顯色譜峰干擾（圖1A、1B，圖2A、2B），表明該分析方法具有很好的專屬性。
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本文編號：2853417