發(fā)布時(shí)間：2020-10-23 15:30

　　 目的:肝癌是在肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞病變引起的肝臟惡性腫瘤,其中肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占90%以上,HCC發(fā)病率位列全球第五位,我國(guó)是HCC發(fā)病率最高的國(guó)家,目前HCC的死亡率位列癌癥相關(guān)死因第三位。即使在發(fā)達(dá)國(guó)家HCC的5年內(nèi)相對(duì)生存率也不到5%,因此,找到可以根除HCC的方法亟待解決。由于現(xiàn)有治療HCC的方法均不理想,所以我們提出了一種新的思路。異常的微環(huán)境是腫瘤發(fā)生的決定因素,異常的微環(huán)境使組織干細(xì)胞接收到的調(diào)節(jié)增殖及分化的信號(hào)失調(diào):分化異常下調(diào)或停滯及增殖信號(hào)明顯上調(diào)進(jìn)而形成腫瘤細(xì)胞。研究表明,癌癥干細(xì)胞(Cancer stem cells,CSCs)和正常干細(xì)胞之間存在著許多相似之處,基于CSCs與正常干細(xì)胞的相似之處,導(dǎo)師齊錦生教授認(rèn)為CSCs是停滯于某發(fā)育階段,而呈無(wú)限增殖的“正常干細(xì)胞”或細(xì)胞的“返祖”現(xiàn)象。據(jù)此,我們認(rèn)為胚胎細(xì)胞具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的能力,這種誘導(dǎo)分化的能力具有組織、時(shí)間和空間特異性,并且沒(méi)有種屬差異。我們的前期研究已經(jīng)表明,用13.5d的胚肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞株HepG2共培養(yǎng),可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞分化,并揭露了其相關(guān)的分子機(jī)制。本研究選取12.5d的小鼠胚肝細(xì)胞對(duì)SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化。近年來(lái),關(guān)于祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)及中草藥(The traditional Chinese medicine,TCM)的研究表明,TCM用于腫瘤的治療具有預(yù)防腫瘤發(fā)生,減毒、提高治療效果,減少腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移三大優(yōu)勢(shì)。其中許多應(yīng)用于腫瘤治療的中藥如密蒙花、半枝蓮等中均含有芹菜素(Apigenin,API)。API作為一種黃酮類的抗癌藥物,在其高劑量時(shí)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,而低劑量是可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化。因此,本研究選取低劑量API作為肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的一種分化的誘導(dǎo)劑和促進(jìn)劑,旨在探討低劑量API能否誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞分化以及能否促進(jìn)胚肝細(xì)胞誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,用梯度濃度API干預(yù)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞株,篩選出誘導(dǎo)SMMC-7721分化的API適宜濃度,然后利用該濃度的API與小鼠胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)共同干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞,對(duì)比API與小鼠胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)分別單獨(dú)作用于SMMC-7721細(xì)胞的差異。用免疫熒光技術(shù),檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞中AFP與HNF-4α蛋白表達(dá)水平變化;用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)技術(shù),檢測(cè)afp與hnf-4α的mRNA表達(dá)水平,通過(guò)2~(-ΔΔCt)法計(jì)算差異;利用免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot,WB)檢測(cè)AFP、HNF-4α蛋白水平的表達(dá)。本研究選取SMMC-7721細(xì)胞株為研究對(duì)象,探索天然植物提取物API對(duì)共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化腫瘤細(xì)胞的促進(jìn)作用,為臨床低毒高效的根除HCC提供新的思路。方法:1細(xì)胞培養(yǎng)1.1 SMMC-7721細(xì)胞:SMMC-7721細(xì)胞用含1%非必需氨基酸和10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),0.25%的胰蛋白酶消化傳代,接種于100mL培養(yǎng)瓶中,在37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2原代胚肝細(xì)胞分離及培養(yǎng):采用Ⅳ膠原酶消化法,從孕鼠腹中取得胎鼠,分離出胚肝,將胚肝組織剪成組織塊,Ⅳ膠原酶消化胚肝組織塊,成功分離為單個(gè)胚肝細(xì)胞;多次重復(fù)差速貼壁法除去成纖維細(xì)胞,純化胚肝細(xì)胞;高糖DMEM培養(yǎng)胚肝細(xì)胞。2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組2.1用梯度濃度API誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721分化72h,實(shí)驗(yàn)分為6組:con組,API 2.5μm/L、API 5μm/L、API 7.5μm/L、API 10μm/L、API12.5μm/L。2.2胎肝細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞用含API的培養(yǎng)基共培養(yǎng),分別進(jìn)行24h與48h。其中小鼠胎肝與SMMC-7721細(xì)胞的共培養(yǎng)體系建立為:利用帶有“transwell”小室的六孔板建立小鼠胚肝細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞的非接觸式共培養(yǎng)體系。實(shí)驗(yàn)分為4組:第:1組為con組;第2組為用誘導(dǎo)SMMC-7721分化能力最強(qiáng),濃度為5μm/L的API組;第3組為小鼠胚肝細(xì)胞與SMMC-7721共培養(yǎng)的co-culture組;第4組為5μm/L的API與小鼠胚肝細(xì)胞共同作用于SMMC-7721的co-culture+API組。4組各進(jìn)行24h與48h后對(duì)比差異。3 API誘導(dǎo)SMMC-7721分化的最適濃度API誘導(dǎo)SMMC-7721分化過(guò)程中,不同濃度API對(duì)SMMC-7721的分化誘導(dǎo)能力是不同的。3.1利用熒光顯微鏡觀察AFP與HNF-4α的分泌量。3.2 Trizol一步法提取SMMC-7721細(xì)胞中總RNA,用β-actin做內(nèi)參,real-time PCR方法檢測(cè)afp和hnf-4α的mRNA表達(dá),計(jì)算afp和hnf-4α的抑制率。4胎肝細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞用含API的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h。4.1利用熒光顯微鏡觀察AFP與HNF-4α的分泌量。4.2 Trizol一步法提取SMMC-7721細(xì)胞中總RNA,用β-actin做內(nèi)參,real-time PCR方法檢測(cè)afp和hnf-4α的mRNA表達(dá),計(jì)算afp和hnf-4α的抑制率。4.3與HNF4α蛋白的分泌,計(jì)算afp和hnf-4α的抑制率。5胎肝細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞用含API的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48h。5.1光鏡下觀察未經(jīng)處理的SMMC-7721與co-culture+API組中SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)有何差異。5.2利用熒光顯微鏡觀察AFP與HNF-4α的分泌量。5.3 Trizol一步法提取SMMC-7721細(xì)胞中總RNA,用β-actin做內(nèi)參,real-time PCR方法檢測(cè)afp和hnf-4α的mRNA表達(dá),計(jì)算afp和hnf-4α的抑制率。5.4收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,用GAPDH做內(nèi)參,用WB法檢測(cè)AFP與HNF4α蛋白的分泌,計(jì)算AFP和HNF-4α的抑制率。結(jié)果:1原代胚肝細(xì)胞的分離純化及培養(yǎng)采用Ⅳ型膠原酶消化法,首先將胚肝組織剪成組織塊,Ⅳ膠原酶消化胚肝組織塊,成功分離為單個(gè)胚肝細(xì)胞;多次重復(fù)差速貼壁法除去成纖維細(xì)胞,純化胚肝細(xì)胞;高糖DMEM培養(yǎng)胚肝細(xì)胞,原代胚肝細(xì)胞培養(yǎng)成功。2免疫熒光法檢測(cè)梯度濃度API誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞72h后,SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)AFP蛋白與HNF-4α蛋白水平的變化。與con組相比,可明顯觀察到5μm/L的API對(duì)SMMC-7721誘導(dǎo)分化能力最強(qiáng),其AFP蛋白水平明顯降低,其HNF4α蛋白水平明顯上升。3 real-time PCR檢測(cè)梯度濃度API誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞72h后,SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)afp與hnf-4αmRNA表達(dá)水平的變化。SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)梯度濃度API處理后,檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞中afp與hnf-4αmRNA的相對(duì)表達(dá)量,與con組比,2.5μm/L組、5μm/L組、7.5μm/L組、10μm/L組、12.5μm/L組中各組afp mRNA均有下調(diào),其中5μm/L組效果顯著;各組hnf-4αmRNA均有上調(diào),其中5μm/L組效果顯著,與免疫熒光結(jié)果一致。4免疫熒光檢測(cè)胎肝細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h后,SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)AFP蛋白與HNF-4α蛋白水平的變化。與con組相比,可觀擦到,API組中AFP蛋白水平無(wú)明顯變化,co-culture組中AFP蛋白水平略有下降,co-culture+API組中AFP蛋白水平也略有下降,其水平為各組中最低;API組中HNF-4α蛋白水平略有上升,co-culture組中HNF-4α蛋白水平略有上升,但低于API組,co-culture+API組中HNF-4α蛋白水平也略有上升,其水平為各組中最高。5 real-time PCR檢測(cè)胎肝細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h后,SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)afp與hnf-4αmRNA表達(dá)水平的變化。SMMC-7721細(xì)胞與12.5d胚肝細(xì)胞加入5μm/L API共培養(yǎng)后,檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞中afp mRNA的相對(duì)表達(dá)量,與con組比,API組、co-culture組、co-culture+API組中各組afp mRNA均有下調(diào),其中co-culture+API組效果顯著;除API組hnf-4αmRNA未明顯變化,其余組均有上調(diào),其中co-culture+API組效果顯著。6 WB法檢測(cè)胎肝細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h后,SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)AFP蛋白與HNF-4α蛋白水平的變化。SMMC-7721細(xì)胞與12.5d胚肝細(xì)胞加入5μm/L API共培養(yǎng)后,檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞中AFP蛋白的相對(duì)表達(dá)量,與con組比,API組、co-culture組、co-culture+API組中各組AFP蛋白相對(duì)表達(dá)量均有下調(diào),其中co-culture+API組效果顯著;各組HNF-4α蛋白相對(duì)表達(dá)量均有上調(diào),其中co-culture+API組效果顯著,且與免疫熒光及real-time PCR結(jié)果一致。7光鏡下觀察co-culture+API組中SMMC-7721細(xì)胞形態(tài),與正常con組相比,12.5d的胚肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞共培養(yǎng),并加入含5μm/L API培養(yǎng)基,培養(yǎng)48h后SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制,且部分細(xì)胞回縮、變圓,最終崩解;另有一部分細(xì)胞未變化,而繼續(xù)培養(yǎng)也不會(huì)增殖。8免疫熒光法檢測(cè)胎肝細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48h后,SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)AFP蛋白與HNF-4α蛋白水平的變化。與con組相比,可觀擦到,API組中AFP蛋白水平略有下降,co-culture組中AFP蛋白水平明顯下降,co-culture+API組中AFP蛋白水平顯著下降,且其水平為各組中最低;API組中HNF-4α蛋白水平明顯上升,co-culture組中HNF-4α蛋白水平明顯上升,但略低于API組,co-culture+API組中HNF-4α蛋白水平顯著上升,且其水平為各組中最高。9 real-time PCR檢測(cè)胎肝細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48h后,SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)afp與hnf-4αmRNA表達(dá)水平的變化。SMMC-7721細(xì)胞與12.5d胚肝細(xì)胞加入5μm/L API共培養(yǎng)后,檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞中afp mRNA的相對(duì)表達(dá)量,與con組比,API組、co-culture組、co-culture+API組中各組afp mRNA均有下調(diào),其中co-culture+API組效果顯著;各組hnf-4αmRNA均有上調(diào),其中co-culture+API組效果顯著。10 WB法檢測(cè)胎肝細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48h后,SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)AFP蛋白與HNF-4α蛋白水平的變化。SMMC-7721細(xì)胞與12.5d胚肝細(xì)胞加入5μm/L API共培養(yǎng)后,檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞中AFP蛋白的相對(duì)表達(dá)量,與con組比,API組、co-culture組、co-culture+API組中各組AFP蛋白的相對(duì)表達(dá)量均有下調(diào),其中co-culture+API組效果顯著;API組、co-culture組、co-culture+API組中各組HNF-4α蛋白的相對(duì)表達(dá)量均有上調(diào),其中co-culture+API組效果顯著,且與免疫熒光及real-time PCR結(jié)果一致。而經(jīng)對(duì)比co-culture+API組,48h比24h效果更加顯著。結(jié)論:1.低濃度API(5μm/L)可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721分化;2,特定時(shí)間(12.5d)的小鼠胚肝細(xì)胞可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721分化;3.API可促進(jìn)小鼠胚肝細(xì)胞與SMMC-7721共培養(yǎng)時(shí)對(duì)SMMC-7721的誘導(dǎo)分化作用,且48h協(xié)同作用達(dá)到峰值。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

36圖 2 免疫熒光檢測(cè)梯度濃度芹菜素處理 SMMC-7721 細(xì)胞 72h 后 AFHNF-4α蛋白變化情況Fig.2 Immunofluorescence Detection ofAFP and HNF-4α Protein ChangSMMC-7721 CellsAfter 72-hour Treatment with Gradient ConcentratiApigeninA: Immunofluorescence Detection of AFP Protein Changes in GraConcentration API-treated SMMC-7721 Cells. B: ImmunofluoresDetection of HNF-4α Protein Changes in Gradient Concentration API-trSMMC-7721 Cells.

圖 3 real-time PCR 檢測(cè)梯度濃度芹菜素處理 SMMC-7721 細(xì)胞 72h 后 afp與 hnf-4α基因的表達(dá)情況Fig.3 Real-time PCR detection of afp and hnf-4α gene expression inSMMC-7721 cells treated with gradient concentration apigenin for 72 hoursA: The total RNA of SMMC-7721 Note: Total RNA of SMMC-7721 usingTrizol kit and the procedures were according to the manufacturer’sinstructions. Extracted RNA with an optical density OD260/OD280 ratiogreater than 1.8 was used for cDNA synthesis. B: The expression of afpmRNA in SMMC-7721 cells treated with real-time PCR. C: The expression ofhnf-4α mRNA in SMMC-7721 cells treated with real-time PCR.(*P <0.05compared with control group ; **P <0.01, compared with control group. )

圖 4 免疫熒光檢測(cè)共培養(yǎng)處理 SMMC-7721 細(xì)胞 24h 后 AFP 與 HNF-4α蛋白變化情況Fig.4 Immunofluorescence Detection ofAFP and HNF-4α Protein Changes inCo-cultured SMMC-7721 CellsAfter 24 HoursA: Immunofluorescence detection of AFP proteins in mouse embryonic livercells inducing differentiation of SMMC-7721 cells. B: Immunofluorescencedetection of HNF-4α proteins in mouse embryonic liver cells inducingdifferentiation of SMMC-7721 cells.
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 Christiana Hadjimichael;Konstantina Chanoumidou;Natalia Papadopoulou;Panagiota Arampatzi;Joseph Papamatheakis;Androniki Kretsovali;;Common stemness regulators of embryonic and cancer stem cells[J];World Journal of Stem Cells;2015年09期

2 黃再超;;芹菜素對(duì)肺癌細(xì)胞的抗腫瘤作用以及增敏作用分析[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2015年78期

3 黃佳穎;楊悅;李玉榮;王星;;芹菜素的研究進(jìn)展[J];江蘇科技信息;2015年04期

4 辛麗麗;張旭;龔婕寧;;芹菜素抗癌機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2013年21期

5 吳唐維;寧勇;陳衛(wèi)群;盧忠心;;微RNA參與中藥抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J];重慶醫(yī)學(xué);2013年13期

6 Xuchen Cao;Bowen Liu;Wenfeng Cao;Weiran Zhang;Fei Zhang;Hongmeng Zhao;Ran Meng;Lin Zhang;Ruifang Niu;Xishan Hao;Bin Zhang;;Autophagy inhibition enhances apigenin-induced apoptosis in human breast cancer cells[J];Chinese Journal of Cancer Research;2013年02期

7 趙國(guó)欣;趙明;劉艷麗;李領(lǐng)川;王立萍;馮沖;;基于電化學(xué)方法的抗癌中草藥密蒙花中芹菜素的研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年09期

8 龍泳伶;龍雪梅;;中醫(yī)治則指導(dǎo)下抗腫瘤中藥的臨床分類[J];中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育;2011年12期

9 黃海英;;抗腫瘤中藥研究現(xiàn)狀[J];實(shí)用中醫(yī)藥雜志;2011年05期

10 文紅波;曹運(yùn)長(zhǎng);董曉英;許金華;曹建國(guó);;芹菜素誘導(dǎo)人肝癌Hep G2細(xì)胞分化[J];湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉歡;芹菜素抗非小細(xì)胞肺癌作用及協(xié)同增敏順鉑抗肺癌作用機(jī)制初步研究[D];廣東藥科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2853211