目的:肝癌是在肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞病變引起的肝臟惡性腫瘤,其中肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占90%以上,HCC發(fā)病率位列全球第五位,我國是HCC發(fā)病率最高的國家,目前HCC的死亡率位列癌癥相關死因第三位。即使在發(fā)達國家HCC的5年內(nèi)相對生存率也不到5%,因此,找到可以根除HCC的方法亟待解決。由于現(xiàn)有治療HCC的方法均不理想,所以我們提出了一種新的思路。異常的微環(huán)境是腫瘤發(fā)生的決定因素,異常的微環(huán)境使組織干細胞接收到的調(diào)節(jié)增殖及分化的信號失調(diào):分化異常下調(diào)或停滯及增殖信號明顯上調(diào)進而形成腫瘤細胞。研究表明,癌癥干細胞(Cancer stem cells,CSCs)和正常干細胞之間存在著許多相似之處,基于CSCs與正常干細胞的相似之處,導師齊錦生教授認為CSCs是停滯于某發(fā)育階段,而呈無限增殖的“正常干細胞”或細胞的“返祖”現(xiàn)象。據(jù)此,我們認為胚胎細胞具有誘導腫瘤細胞分化的能力,這種誘導分化的能力具有組織、時間和空間特異性,并且沒有種屬差異。我們的前期研究已經(jīng)表明,用13.5d的胚肝細胞與肝癌細胞株HepG2共培養(yǎng),可以誘導HepG2細胞分化,并揭露了其相關的分子機制。本研究選取12.5d的小鼠胚肝細胞對SMMC-7721細胞進行誘導分化。近年來,關于祖國傳統(tǒng)醫(yī)學及中草藥(The traditional Chinese medicine,TCM)的研究表明,TCM用于腫瘤的治療具有預防腫瘤發(fā)生,減毒、提高治療效果,減少腫瘤復發(fā)和轉移三大優(yōu)勢。其中許多應用于腫瘤治療的中藥如密蒙花、半枝蓮等中均含有芹菜素(Apigenin,API)。API作為一種黃酮類的抗癌藥物,在其高劑量時可誘導腫瘤細胞凋亡,而低劑量是可誘導腫瘤細胞分化。因此,本研究選取低劑量API作為肝癌細胞株SMMC-7721的一種分化的誘導劑和促進劑,旨在探討低劑量API能否誘導SMMC-7721細胞分化以及能否促進胚肝細胞誘導SMMC-7721細胞分化。本實驗在前期實驗基礎上,用梯度濃度API干預肝癌細胞株SMMC-7721細胞株,篩選出誘導SMMC-7721分化的API適宜濃度,然后利用該濃度的API與小鼠胚肝細胞共培養(yǎng)共同干預SMMC-7721細胞,對比API與小鼠胚肝細胞共培養(yǎng)分別單獨作用于SMMC-7721細胞的差異。用免疫熒光技術,檢測SMMC-7721細胞中AFP與HNF-4α蛋白表達水平變化;用實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)技術,檢測afp與hnf-4α的mRNA表達水平,通過2~(-ΔΔCt)法計算差異;利用免疫印跡試驗(Western Blot,WB)檢測AFP、HNF-4α蛋白水平的表達。本研究選取SMMC-7721細胞株為研究對象,探索天然植物提取物API對共培養(yǎng)誘導分化腫瘤細胞的促進作用,為臨床低毒高效的根除HCC提供新的思路。方法:1細胞培養(yǎng)1.1 SMMC-7721細胞:SMMC-7721細胞用含1%非必需氨基酸和10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),0.25%的胰蛋白酶消化傳代,接種于100mL培養(yǎng)瓶中,在37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2原代胚肝細胞分離及培養(yǎng):采用Ⅳ膠原酶消化法,從孕鼠腹中取得胎鼠,分離出胚肝,將胚肝組織剪成組織塊,Ⅳ膠原酶消化胚肝組織塊,成功分離為單個胚肝細胞;多次重復差速貼壁法除去成纖維細胞,純化胚肝細胞;高糖DMEM培養(yǎng)胚肝細胞。2實驗設計與分組2.1用梯度濃度API誘導肝癌細胞SMMC-7721分化72h,實驗分為6組:con組,API 2.5μm/L、API 5μm/L、API 7.5μm/L、API 10μm/L、API12.5μm/L。2.2胎肝細胞與SMMC-7721細胞用含API的培養(yǎng)基共培養(yǎng),分別進行24h與48h。其中小鼠胎肝與SMMC-7721細胞的共培養(yǎng)體系建立為:利用帶有“transwell”小室的六孔板建立小鼠胚肝細胞與SMMC-7721細胞的非接觸式共培養(yǎng)體系。實驗分為4組:第:1組為con組;第2組為用誘導SMMC-7721分化能力最強,濃度為5μm/L的API組;第3組為小鼠胚肝細胞與SMMC-7721共培養(yǎng)的co-culture組;第4組為5μm/L的API與小鼠胚肝細胞共同作用于SMMC-7721的co-culture+API組。4組各進行24h與48h后對比差異。3 API誘導SMMC-7721分化的最適濃度API誘導SMMC-7721分化過程中,不同濃度API對SMMC-7721的分化誘導能力是不同的。3.1利用熒光顯微鏡觀察AFP與HNF-4α的分泌量。3.2 Trizol一步法提取SMMC-7721細胞中總RNA,用β-actin做內(nèi)參,real-time PCR方法檢測afp和hnf-4α的mRNA表達,計算afp和hnf-4α的抑制率。4胎肝細胞與SMMC-7721細胞用含API的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h。4.1利用熒光顯微鏡觀察AFP與HNF-4α的分泌量。4.2 Trizol一步法提取SMMC-7721細胞中總RNA,用β-actin做內(nèi)參,real-time PCR方法檢測afp和hnf-4α的mRNA表達,計算afp和hnf-4α的抑制率。4.3與HNF4α蛋白的分泌,計算afp和hnf-4α的抑制率。5胎肝細胞與SMMC-7721細胞用含API的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48h。5.1光鏡下觀察未經(jīng)處理的SMMC-7721與co-culture+API組中SMMC-7721細胞形態(tài)有何差異。5.2利用熒光顯微鏡觀察AFP與HNF-4α的分泌量。5.3 Trizol一步法提取SMMC-7721細胞中總RNA,用β-actin做內(nèi)參,real-time PCR方法檢測afp和hnf-4α的mRNA表達,計算afp和hnf-4α的抑制率。5.4收集細胞,提取細胞總蛋白,用GAPDH做內(nèi)參,用WB法檢測AFP與HNF4α蛋白的分泌,計算AFP和HNF-4α的抑制率。結果:1原代胚肝細胞的分離純化及培養(yǎng)采用Ⅳ型膠原酶消化法,首先將胚肝組織剪成組織塊,Ⅳ膠原酶消化胚肝組織塊,成功分離為單個胚肝細胞;多次重復差速貼壁法除去成纖維細胞,純化胚肝細胞;高糖DMEM培養(yǎng)胚肝細胞,原代胚肝細胞培養(yǎng)成功。2免疫熒光法檢測梯度濃度API誘導SMMC-7721細胞72h后,SMMC-7721細胞內(nèi)AFP蛋白與HNF-4α蛋白水平的變化。與con組相比,可明顯觀察到5μm/L的API對SMMC-7721誘導分化能力最強,其AFP蛋白水平明顯降低,其HNF4α蛋白水平明顯上升。3 real-time PCR檢測梯度濃度API誘導SMMC-7721細胞72h后,SMMC-7721細胞內(nèi)afp與hnf-4αmRNA表達水平的變化。SMMC-7721細胞經(jīng)梯度濃度API處理后,檢測SMMC-7721細胞中afp與hnf-4αmRNA的相對表達量,與con組比,2.5μm/L組、5μm/L組、7.5μm/L組、10μm/L組、12.5μm/L組中各組afp mRNA均有下調(diào),其中5μm/L組效果顯著;各組hnf-4αmRNA均有上調(diào),其中5μm/L組效果顯著,與免疫熒光結果一致。4免疫熒光檢測胎肝細胞與SMMC-7721細胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h后,SMMC-7721細胞內(nèi)AFP蛋白與HNF-4α蛋白水平的變化。與con組相比,可觀擦到,API組中AFP蛋白水平無明顯變化,co-culture組中AFP蛋白水平略有下降,co-culture+API組中AFP蛋白水平也略有下降,其水平為各組中最低;API組中HNF-4α蛋白水平略有上升,co-culture組中HNF-4α蛋白水平略有上升,但低于API組,co-culture+API組中HNF-4α蛋白水平也略有上升,其水平為各組中最高。5 real-time PCR檢測胎肝細胞與SMMC-7721細胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h后,SMMC-7721細胞內(nèi)afp與hnf-4αmRNA表達水平的變化。SMMC-7721細胞與12.5d胚肝細胞加入5μm/L API共培養(yǎng)后,檢測SMMC-7721細胞中afp mRNA的相對表達量,與con組比,API組、co-culture組、co-culture+API組中各組afp mRNA均有下調(diào),其中co-culture+API組效果顯著;除API組hnf-4αmRNA未明顯變化,其余組均有上調(diào),其中co-culture+API組效果顯著。6 WB法檢測胎肝細胞與SMMC-7721細胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h后,SMMC-7721細胞內(nèi)AFP蛋白與HNF-4α蛋白水平的變化。SMMC-7721細胞與12.5d胚肝細胞加入5μm/L API共培養(yǎng)后,檢測SMMC-7721細胞中AFP蛋白的相對表達量,與con組比,API組、co-culture組、co-culture+API組中各組AFP蛋白相對表達量均有下調(diào),其中co-culture+API組效果顯著;各組HNF-4α蛋白相對表達量均有上調(diào),其中co-culture+API組效果顯著,且與免疫熒光及real-time PCR結果一致。7光鏡下觀察co-culture+API組中SMMC-7721細胞形態(tài),與正常con組相比,12.5d的胚肝細胞與肝癌細胞SMMC-7721細胞共培養(yǎng),并加入含5μm/L API培養(yǎng)基,培養(yǎng)48h后SMMC-7721細胞生長明顯受到抑制,且部分細胞回縮、變圓,最終崩解;另有一部分細胞未變化,而繼續(xù)培養(yǎng)也不會增殖。8免疫熒光法檢測胎肝細胞與SMMC-7721細胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48h后,SMMC-7721細胞內(nèi)AFP蛋白與HNF-4α蛋白水平的變化。與con組相比,可觀擦到,API組中AFP蛋白水平略有下降,co-culture組中AFP蛋白水平明顯下降,co-culture+API組中AFP蛋白水平顯著下降,且其水平為各組中最低;API組中HNF-4α蛋白水平明顯上升,co-culture組中HNF-4α蛋白水平明顯上升,但略低于API組,co-culture+API組中HNF-4α蛋白水平顯著上升,且其水平為各組中最高。9 real-time PCR檢測胎肝細胞與SMMC-7721細胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48h后,SMMC-7721細胞內(nèi)afp與hnf-4αmRNA表達水平的變化。SMMC-7721細胞與12.5d胚肝細胞加入5μm/L API共培養(yǎng)后,檢測SMMC-7721細胞中afp mRNA的相對表達量,與con組比,API組、co-culture組、co-culture+API組中各組afp mRNA均有下調(diào),其中co-culture+API組效果顯著;各組hnf-4αmRNA均有上調(diào),其中co-culture+API組效果顯著。10 WB法檢測胎肝細胞與SMMC-7721細胞用含API(5μm/L)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48h后,SMMC-7721細胞內(nèi)AFP蛋白與HNF-4α蛋白水平的變化。SMMC-7721細胞與12.5d胚肝細胞加入5μm/L API共培養(yǎng)后,檢測SMMC-7721細胞中AFP蛋白的相對表達量,與con組比,API組、co-culture組、co-culture+API組中各組AFP蛋白的相對表達量均有下調(diào),其中co-culture+API組效果顯著;API組、co-culture組、co-culture+API組中各組HNF-4α蛋白的相對表達量均有上調(diào),其中co-culture+API組效果顯著,且與免疫熒光及real-time PCR結果一致。而經(jīng)對比co-culture+API組,48h比24h效果更加顯著。結論:1.低濃度API(5μm/L)可誘導肝癌細胞SMMC-7721分化;2,特定時間(12.5d)的小鼠胚肝細胞可誘導肝癌細胞SMMC-7721分化;3.API可促進小鼠胚肝細胞與SMMC-7721共培養(yǎng)時對SMMC-7721的誘導分化作用,且48h協(xié)同作用達到峰值。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

36圖 2 免疫熒光檢測梯度濃度芹菜素處理 SMMC-7721 細胞 72h 后 AFHNF-4α蛋白變化情況Fig.2 Immunofluorescence Detection ofAFP and HNF-4α Protein ChangSMMC-7721 CellsAfter 72-hour Treatment with Gradient ConcentratiApigeninA: Immunofluorescence Detection of AFP Protein Changes in GraConcentration API-treated SMMC-7721 Cells. B: ImmunofluoresDetection of HNF-4α Protein Changes in Gradient Concentration API-trSMMC-7721 Cells.

圖 3 real-time PCR 檢測梯度濃度芹菜素處理 SMMC-7721 細胞 72h 后 afp與 hnf-4α基因的表達情況Fig.3 Real-time PCR detection of afp and hnf-4α gene expression inSMMC-7721 cells treated with gradient concentration apigenin for 72 hoursA: The total RNA of SMMC-7721 Note: Total RNA of SMMC-7721 usingTrizol kit and the procedures were according to the manufacturer’sinstructions. Extracted RNA with an optical density OD260/OD280 ratiogreater than 1.8 was used for cDNA synthesis. B: The expression of afpmRNA in SMMC-7721 cells treated with real-time PCR. C: The expression ofhnf-4α mRNA in SMMC-7721 cells treated with real-time PCR.(*P <0.05compared with control group ; **P <0.01, compared with control group. )

圖 4 免疫熒光檢測共培養(yǎng)處理 SMMC-7721 細胞 24h 后 AFP 與 HNF-4α蛋白變化情況Fig.4 Immunofluorescence Detection ofAFP and HNF-4α Protein Changes inCo-cultured SMMC-7721 CellsAfter 24 HoursA: Immunofluorescence detection of AFP proteins in mouse embryonic livercells inducing differentiation of SMMC-7721 cells. B: Immunofluorescencedetection of HNF-4α proteins in mouse embryonic liver cells inducingdifferentiation of SMMC-7721 cells.
【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 Christiana Hadjimichael;Konstantina Chanoumidou;Natalia Papadopoulou;Panagiota Arampatzi;Joseph Papamatheakis;Androniki Kretsovali;;Common stemness regulators of embryonic and cancer stem cells[J];World Journal of Stem Cells;2015年09期

2 黃再超;;芹菜素對肺癌細胞的抗腫瘤作用以及增敏作用分析[J];世界最新醫(yī)學信息文摘;2015年78期

3 黃佳穎;楊悅;李玉榮;王星;;芹菜素的研究進展[J];江蘇科技信息;2015年04期

4 辛麗麗;張旭;龔婕寧;;芹菜素抗癌機制研究進展[J];中國實驗方劑學雜志;2013年21期

5 吳唐維;寧勇;陳衛(wèi)群;盧忠心;;微RNA參與中藥抗腫瘤作用的研究進展[J];重慶醫(yī)學;2013年13期

6 Xuchen Cao;Bowen Liu;Wenfeng Cao;Weiran Zhang;Fei Zhang;Hongmeng Zhao;Ran Meng;Lin Zhang;Ruifang Niu;Xishan Hao;Bin Zhang;;Autophagy inhibition enhances apigenin-induced apoptosis in human breast cancer cells[J];Chinese Journal of Cancer Research;2013年02期

7 趙國欣;趙明;劉艷麗;李領川;王立萍;馮沖;;基于電化學方法的抗癌中草藥密蒙花中芹菜素的研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2012年09期

8 龍泳伶;龍雪梅;;中醫(yī)治則指導下抗腫瘤中藥的臨床分類[J];中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育;2011年12期

9 黃海英;;抗腫瘤中藥研究現(xiàn)狀[J];實用中醫(yī)藥雜志;2011年05期

10 文紅波;曹運長;董曉英;許金華;曹建國;;芹菜素誘導人肝癌Hep G2細胞分化[J];湖南師范大學學報(醫(yī)學版);2007年03期

相關碩士學位論文 前1條

1 劉歡;芹菜素抗非小細胞肺癌作用及協(xié)同增敏順鉑抗肺癌作用機制初步研究[D];廣東藥科大學;2017年

本文編號：2853211