黃芪藥渣中半纖維素多糖的提取純化、結構解析及抗腫瘤、抗菌膜活性物質(zhì)的篩選

發(fā)布時間：2020-10-22 14:15

　　選題依據(jù):黃芪,是我國非常重要的大宗藥材之一。根據(jù)估算,每年我國使用的黃芪藥材達到了10萬噸,因此每年會有數(shù)萬噸黃芪藥渣產(chǎn)生。當前,對藥渣的再利用都集中應用于制成各種食用菌的底料、制成肥料、動物飼料等。但是這些衍生產(chǎn)品的附加值比較低,在生產(chǎn)過程中甚至會造成環(huán)境的二次污染。中藥藥渣主要由細胞壁的成分組成,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)一些植物細胞壁的組分(半纖維素、果膠)中含有許多具有不同生物活性的多糖成分,因此被稱為未被開發(fā)的“藥物資源庫”。周素梅等發(fā)現(xiàn)麥麩細胞壁半纖維素中的阿拉伯木聚糖的抗腫瘤活性比較高。本課題組前期發(fā)現(xiàn)黃芪藥渣中的半纖維素主要含有阿拉伯糖和木糖等單糖,推測該多糖組分可能具有抗腫瘤等生物活性。因此,從黃芪藥渣中開發(fā)具有抗腫瘤等生物活性的多糖產(chǎn)品,對于實現(xiàn)黃芪資源的充分利用具有重大意義。目的:提取純化黃芪藥渣中的半纖維素,解析其結構,并評價其體外抗氧化活性、抗人肺腺癌細胞的活性以及抗菌膜活性。為黃芪藥渣中具有生物活性的多糖的開發(fā)利用提供理論基礎。研究方法與研究內(nèi)容:通過分級提取法從黃芪藥渣中提取半纖維素,運用離子交換層析、凝膠過濾層析對提取的藥渣半纖維素進行了分離純化。運用凝膠色譜法測定藥渣半纖維素的相對分子質(zhì)量,采用GC-MS法測定其單糖組成,通過甲基化方法確定單糖之間的連接位點,并結合IR、NMR分析其結構。體外抗氧化活性評價包括羥自由基、超氧自由基、DPPH清除實驗。評價了黃芪藥渣半纖維素對人肺腺癌細胞A549細胞和人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞的增殖抑制作用。建立了體外菌膜模型并用于篩選抗菌膜活性物質(zhì)。評價了黃芪藥渣半纖維素、微生物代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌菌膜的破壞作用。研究結果:1、從黃芪藥渣中提取純化獲得了4個半纖維素組分,分別記為AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3、AX-I-4。2、研究了4個半纖維素組分的化學結構,發(fā)現(xiàn)AX-I-1含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩爾比為0.006:14.113:8.284:0.116:0.468:1,通過甲基化分析確定其主鏈中含有阿拉伯糖和木糖,并通過β-(1→2),(1→3),(1→4)糖苷鍵組成,支鏈由(1→4)βArap,(1→3)βGalp,(1→2)βMan組成,非還原末端由αRhap,βGclp,βGalp組成。發(fā)現(xiàn)AX-I-2中含有阿拉伯糖、木糖,其摩爾比為11.2:8.9。AX-I-2中單糖殘基的連接方式為:→4)-D-Xylp-(1→、→4)-D-Arap-(1→。AX-I-3中含有阿拉伯糖、木糖、葡萄糖,通過計算得到其摩爾比為10.4:79.3:1.1。AX-I-3中單糖殘基的連接方式為:→2,3,4)β-D-Xylp(1→、→4)β-D-Arap(1→、→5)β-D-Glcp(1→。AX-I-4中含有阿拉伯糖、木糖、葡萄糖,通過計算得到其摩爾比為12.6:76.1:2.4。AX-I-4中單糖殘基的連接方式為:→2,3,4)β-D-Xylp(1→、→4)β-D-Arap(1→、→5)β-D-Glcp(1→。3、當濃度在0.1~0.5 mg/mL之間時,4種半纖維素對羥自由基的清除率在5%左右。AX-I-1對超氧自由基的體外清除率在10%左右,AX-I-2,AX-I-3對超氧自由基的體外清除率在30%左右,AX-I-4對超氧自由基的體外清除率在40%左右。當多糖濃度在0.1~0.5 mg/mL之間時,AX-I-2,AX-I-3和AX-I-4對DPPH的體外清除率在30%左右。AX-I-1對DPPH的體外清除率在5%左右。4、當AX-I-1的濃度為1 mg/mL時,AX-I-1對A549細胞有殺傷作用,給藥后其細胞活力在70%左右。在該濃度下AX-I-1對BEAS-2B細胞也有較強的殺傷作用。當AX-I-3的濃度在100~1000μg/mL之間時,AX-I-3對A549細胞有較強的殺傷作用。當AX-I-3的濃度為1 mg/mL時,給藥后其細胞活力在50%左右。當AX-I-4的濃度在200~1000μg/mL之間時,AX-I-4對A549細胞有殺傷作用,給藥后其細胞活力在80%左右。5、AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3、AX-I-4對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌菌膜均無破壞作用。大腸桿菌、綠膿桿菌和乳桿菌L1/L5/L7的代謝產(chǎn)物對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌菌膜均具有顯著的破壞作用。并發(fā)現(xiàn)大腸桿菌代謝產(chǎn)物中抗菌膜活性成分是蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)通過下調(diào)金黃色葡萄球菌菌膜形成相關基因的轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮抗菌膜作用。大腸桿菌、綠膿桿菌和乳桿菌L1/L5/L7的代謝產(chǎn)物對白色念珠菌的生長無顯著性影響。大腸桿菌和綠膿桿菌的代謝產(chǎn)物對金葡菌的生長有一定的影響,乳桿菌L1/L5/L7的代謝產(chǎn)物完全抑制其生長。結論:從黃芪藥渣中提取純化獲得了4個半纖維素組分。采用HPLC凝膠色譜法、GC-MS單糖組成分析、GC-MS甲基化分析、IR和NMR解析了AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3、AX-I-4的結構。評價了4種半纖維素組分的抗氧化活性,并評價4種半纖維素組分的抗腫瘤、抗菌膜活性。結果表明AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3和AX-I-4均有一定的體外抗氧化活性。AX-I-3對A549細胞有較強的殺傷作用,同時也能殺傷BEAS-2B細胞,有一定的細胞毒性。AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3和AX-I-4均無抗白色念珠菌、金黃色葡萄球菌菌膜活性。
【學位單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R284;R285
【部分圖文】：

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第三章黃芪藥渣半纖維素的提取純化以 lgMw為縱軸，作圖，得到標曲，并計算得到線性方程。糖 AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3、AX-I-4 分別配制成濃度為 2 mg得的 tR帶入方程即可計算得到其相對分子質(zhì)量。結果藥渣半纖維素多糖 AX-I 的純度和得率中提取得到的黃芪藥渣半纖維素多糖 AX-I 為淡黃色粉末，粗素多糖含量為 78.1%，經(jīng) Sevage 法除蛋白后多糖含量 92.3%。age 法除蛋白質(zhì)條件優(yōu)化該實驗探討得出用 Sevage 法除藥渣粗多糖中的蛋白質(zhì)需要的 3.1 可知，Sevage 法除蛋白質(zhì)重復 4 次后，蛋白質(zhì)殘留量僅有量仍有較大的增加，因此得出 Sevage 法脫除藥渣多糖中蛋白為 4 次。

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