選題依據(jù):蕓豆是一種古老的蔬菜作物和糧食作物,以味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而聞名。紅蕓豆(Phaseolus vulgaris L.),又名紅菜豆,是一種在全球范圍內(nèi)商業(yè)化生產(chǎn)和消費(fèi)的食用豆。最近的研究表明,紅蕓豆具有抗氧化的生物活性。紅蕓豆中富含植物凝集素(PHA),PHA已被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤,抗真菌,抗病毒和α-葡萄糖苷酶抑制等一系列生物活性。黑色素瘤是一種由黑色素細(xì)胞引起的惡性腫瘤,其死亡率占皮膚癌死亡率的80%,且五年生存率低于5%。因此,尋找具有抑制黑色素瘤能力的藥物刻不容緩。已有研究表明桑椹花色苷可抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、柑橘汁提取物可抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖。紅蕓豆具有鮮紅的種皮,其顏色可能在于其含有花色苷類成分,因此,我們推測(cè)紅蕓豆可能具有潛在的抗黑色素瘤作用。山西是紅蕓豆的主產(chǎn)區(qū),為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用山西優(yōu)質(zhì)紅蕓豆資源,本研究擬對(duì)紅蕓豆抗黑色素瘤活性成分及其機(jī)制進(jìn)行研究,為把紅蕓豆進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為治療黑色素瘤的潛在藥物和功能食品提供依據(jù)。目的:本課題以山西特產(chǎn)紅蕓豆為研究對(duì)象,采用B16-F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞模型,通過(guò)化學(xué)分析、細(xì)胞生物學(xué)、代謝組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)等多學(xué)科方法闡明紅蕓豆皮提取物抗黑色素瘤的活性成分和作用機(jī)制,為紅蕓豆的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。方法:(1)通過(guò)~1H-NMR及LC-MS分析,結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照,分別對(duì)紅蕓豆皮及去皮種子提取物的化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。(2)采用小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞模型,首先通過(guò)觀察紅蕓豆皮提取物(RKBC)和去皮種子提取物(RKBK)對(duì)細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行抗黑色素瘤作用藥效評(píng)價(jià);其次,利用基于LC-MS的細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探究其抗黑色素瘤的作用機(jī)制;最后,采用Western blot對(duì)相關(guān)通路、靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。(3)進(jìn)一步將RKBC提取物分為石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(BU)、剩余水層(W)四個(gè)萃取部位。通過(guò)分析四個(gè)萃取部位對(duì)B16-F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞的存活率、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡的影響,明確紅蕓豆皮抗黑色素瘤活性部位;采用液質(zhì)聯(lián)用、結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照對(duì)活性部位的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,采用高效液相色譜和pH示差法對(duì)活性部位進(jìn)行定量分析。(4)通過(guò)Western blot分析活性部位對(duì)細(xì)胞程序性死亡相關(guān)蛋白的作用,確認(rèn)其可能的作用通路。對(duì)活性部位中鑒定的單體進(jìn)行細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡的藥效評(píng)價(jià),選擇活性最佳的單體進(jìn)行細(xì)胞程序性死亡相關(guān)通路的驗(yàn)證。結(jié)果:(1)采用NMR分析,從RKBC及RKBK提取物中共鑒定化合物29個(gè),主要為氨基酸、糖和有機(jī)酸。采用LC-MS分析,從RKBC提取物中共鑒定化合物15個(gè),主要為原花青素類、花色苷類及黃酮醇類成分;從RKBK提取物中共鑒定化合物5個(gè),主要為大豆皂苷類。結(jié)果表明,RKBC和RKBK提取物具有相似的初級(jí)代謝物,但次級(jí)代謝物存在很大的差異。原花青素,黃酮醇類成分和花色苷類成分是RKBC提取物的主要成分,大豆皂甙則為RKBK提取物的主要成分。(2)RKBC提取物對(duì)B16-F10細(xì)胞抑制作用的IC_(50)為36.93±2.74μg/mL,說(shuō)明對(duì)B16-F10細(xì)胞具有明顯的抑制作用;而RKBK提取物在6.25-200μg/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)B16-F10細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用。此外,RKBC提取物還可以濃度依賴性抑制細(xì)胞遷移,誘導(dǎo)G1期和G2/M期阻滯,并引發(fā)細(xì)胞凋亡和空泡化。細(xì)胞代謝組學(xué)結(jié)果表明RKBC提取物的抗黑色素瘤作用可能與嘌呤代謝有關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示RKBC可能通過(guò)調(diào)節(jié)CDK2和CDK4影響細(xì)胞周期。Western Blot分析發(fā)現(xiàn)RKBC可降低AKT1/2/3和cleaved-MMP2的水平,并上調(diào)Bcl-xl的表達(dá)。(3)EA、BU、W和PE四個(gè)部位均能抑制B16-F10細(xì)胞增殖,EA、BU和W在6.25-100μg/mL的濃度范圍內(nèi)的IC_(50)分別為12.57±0.95μg/mL、11.71±4.44μg/mL、32.80±4.58μg/mL,而PE部位在此范圍的最大抑制率僅為35%。從IC_(50)值可以看出BU抑制B16-F10細(xì)胞增殖的活性最強(qiáng),其次是EA、W和PE。細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡、AO/EB和Hoechst 33342染色試驗(yàn)結(jié)果顯示,BU部位在抑制細(xì)胞遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡方面作用較強(qiáng)�；钚圆课欢ㄐ苑治鼋Y(jié)果顯示,EA、BU和W的化學(xué)組成存在顯著差異。EA部位以金絲桃苷和槲皮素為主,BU部位以保留時(shí)間為9.09 min的色譜峰和金絲桃苷為主,W部位以保留時(shí)間為2.63min和9.09 min的色譜峰為主。此外,保留時(shí)間為9.09 min的色譜峰通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用分析推測(cè)為以槲皮素為母核的黃酮類成分,但具體結(jié)構(gòu)未定。定量分析結(jié)果顯示,EA、BU和W三個(gè)部位中金絲桃苷含量分別為3.534±0.055、1.716±0.008、0.930±0.003μg/μL,槲皮素含量分別為2.839±0.009、0.811±0.008、0.264±0.010μg/μL;總花色苷含量分別為0.374、0.227、0.107 mg/g。(4)Western blot分析顯示BU部位對(duì)與細(xì)胞程序性死亡調(diào)控相關(guān)的AKT1/2/3,p-AKT1/2/3,PARP,Bim和Bcl-xl均有一定作用,說(shuō)明BU部位可能通過(guò)影響AKT1/2/3-Bim通路和上調(diào)Bcl-xl的表達(dá)促進(jìn)B16-F10細(xì)胞的程序性死亡。金絲桃苷、槲皮素和山柰酚的抗黑色素瘤活性結(jié)果顯示,槲皮素(IC_(50)為17.88±1.28μg/mL)的抗黑色素瘤活性最強(qiáng),山柰酚次之,金絲桃苷最弱。Western blot的結(jié)果顯示槲皮素對(duì)細(xì)胞程序性死亡的機(jī)制與BU部位相同。結(jié)論:本文通過(guò)NMR結(jié)合LC-MS分析,共鑒定出紅蕓豆提取物的55種化合物。發(fā)現(xiàn)RKBC提取物和RKBK提取物具有相似的初級(jí)代謝物,但次級(jí)代謝物存在顯著差異。采用小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10模型證明紅蕓豆皮具有顯著的抗黑色素瘤活性,而去皮種子無(wú)明顯作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RKBC提取物發(fā)揮抗黑色素瘤作用可能通過(guò)抑制AKT1/2/3-MMP2通路從而抑制細(xì)胞遷移,抑制CDK2和CDK4的表達(dá)阻滯細(xì)胞周期,激活cGMP-PKG通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡,上調(diào)Bcl-xl的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞空泡化等途徑實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步的活性部位篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BU部位具有較強(qiáng)的抗黑色素瘤作用,其對(duì)細(xì)胞程序性死亡機(jī)制在于影響AKT1/2/3-Bim通路和上調(diào)Bcl-xl的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。BU中含有的槲皮素可能為RKBC提取物抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖的主要活性成分之一。以上研究結(jié)果初步闡明紅蕓豆提取物抑制黑色素瘤細(xì)胞的活性成分和作用機(jī)制,為基于紅蕓豆的黑色素瘤治療藥物或功能食品研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

紅蕓豆抗黑色素瘤活性成分及機(jī)制研究本研究擬以山西特產(chǎn)紅蕓豆為研究對(duì)象，以 B16-F10 小鼠黑色素瘤細(xì)胞為模過(guò) NMR 及 LC-MS 技術(shù)對(duì)紅蕓豆皮和去皮種子提取物的化學(xué)成分進(jìn)行研究，者化學(xué)成分差異。然后，進(jìn) 步采用常規(guī)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活胞創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)、細(xì)胞周期檢測(cè)等，并綜合運(yùn)用代謝組學(xué)、理學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，分析其抗黑色素瘤的作用機(jī)制。將紅蕓豆皮進(jìn) 步分離的萃取部位，分析其對(duì) B16-F10 小鼠黑色素瘤細(xì)胞的存活率、細(xì)胞遷移、細(xì)的影響，明確紅蕓豆皮抗黑色素瘤活性部位；采用液質(zhì)聯(lián)用、結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)效液相和 pH 示差法對(duì)活性部位定性、定量分析。最后，通過(guò) Western blot 確部位對(duì)細(xì)胞程序性死亡相關(guān)蛋白的作用及作用通路。對(duì)活性部位中的單體進(jìn)存活率、細(xì)胞凋亡的藥效評(píng)價(jià)，選擇活性最佳的單體進(jìn)行細(xì)胞程序性死亡相的驗(yàn)證。

3.2 紅蕓豆提取物的 TIC 圖。（A）RKBC 提取物負(fù)離子模式的 TIC 圖；（B）RKBC 提取物正子模式的 TIC 圖；（C）RKBK 提取物負(fù)離子模式的 TIC 圖；（D）RKBK 提取物正離子模式 TIC 圖。.5 本章小結(jié)本章對(duì)紅蕓豆提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析，共指認(rèn) 49 個(gè)化合物。通過(guò)1H-NMR

1 RKBC 和 RKBK 提取物的抗增殖作用和不同濃度 RKBC 對(duì) B16-F10 細(xì)胞的使用 MTT 法檢測(cè)的 RKBC 提取物對(duì) B16-F10 細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響。用 R胞 24 h，數(shù)據(jù)來(lái)自三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)并呈現(xiàn)為吸光度。（B）MTT 法檢測(cè)的 R-F10 細(xì)胞活力的影響。用 RKBK 提取物處理細(xì)胞 24 h。數(shù)據(jù)來(lái)自三個(gè)獨(dú)立的度。*P≤0.05，**P≤0.01 且***P≤0.001。（C）細(xì)胞創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)。給藥孵育鏡拍攝的圖像。
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本文編號(hào)：2850989