選題依據(jù):蕓豆是一種古老的蔬菜作物和糧食作物,以味道鮮美、營養(yǎng)豐富而聞名。紅蕓豆(Phaseolus vulgaris L.),又名紅菜豆,是一種在全球范圍內(nèi)商業(yè)化生產(chǎn)和消費的食用豆。最近的研究表明,紅蕓豆具有抗氧化的生物活性。紅蕓豆中富含植物凝集素(PHA),PHA已被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤,抗真菌,抗病毒和α-葡萄糖苷酶抑制等一系列生物活性。黑色素瘤是一種由黑色素細胞引起的惡性腫瘤,其死亡率占皮膚癌死亡率的80%,且五年生存率低于5%。因此,尋找具有抑制黑色素瘤能力的藥物刻不容緩。已有研究表明桑椹花色苷可抑制小鼠黑色素瘤細胞轉(zhuǎn)移、柑橘汁提取物可抑制黑色素瘤細胞的增殖。紅蕓豆具有鮮紅的種皮,其顏色可能在于其含有花色苷類成分,因此,我們推測紅蕓豆可能具有潛在的抗黑色素瘤作用。山西是紅蕓豆的主產(chǎn)區(qū),為了進一步開發(fā)利用山西優(yōu)質(zhì)紅蕓豆資源,本研究擬對紅蕓豆抗黑色素瘤活性成分及其機制進行研究,為把紅蕓豆進一步開發(fā)為治療黑色素瘤的潛在藥物和功能食品提供依據(jù)。目的:本課題以山西特產(chǎn)紅蕓豆為研究對象,采用B16-F10小鼠黑色素瘤細胞模型,通過化學分析、細胞生物學、代謝組學、網(wǎng)絡藥理學和多元統(tǒng)計分析技術等多學科方法闡明紅蕓豆皮提取物抗黑色素瘤的活性成分和作用機制,為紅蕓豆的進一步開發(fā)奠定基礎。方法:(1)通過~1H-NMR及LC-MS分析,結(jié)合文獻數(shù)據(jù)及標準品對照,分別對紅蕓豆皮及去皮種子提取物的化學成分進行結(jié)構(gòu)鑒定。(2)采用小鼠黑色素瘤B16-F10細胞模型,首先通過觀察紅蕓豆皮提取物(RKBC)和去皮種子提取物(RKBK)對細胞存活率、細胞遷移、細胞周期、細胞凋亡的影響進行抗黑色素瘤作用藥效評價;其次,利用基于LC-MS的細胞代謝組學技術和網(wǎng)絡藥理學初步探究其抗黑色素瘤的作用機制;最后,采用Western blot對相關通路、靶點進行驗證。(3)進一步將RKBC提取物分為石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(BU)、剩余水層(W)四個萃取部位。通過分析四個萃取部位對B16-F10小鼠黑色素瘤細胞的存活率、細胞遷移、細胞凋亡的影響,明確紅蕓豆皮抗黑色素瘤活性部位;采用液質(zhì)聯(lián)用、結(jié)合標準品對照對活性部位的化學成分進行定性分析,采用高效液相色譜和pH示差法對活性部位進行定量分析。(4)通過Western blot分析活性部位對細胞程序性死亡相關蛋白的作用,確認其可能的作用通路。對活性部位中鑒定的單體進行細胞存活率、細胞凋亡的藥效評價,選擇活性最佳的單體進行細胞程序性死亡相關通路的驗證。結(jié)果:(1)采用NMR分析,從RKBC及RKBK提取物中共鑒定化合物29個,主要為氨基酸、糖和有機酸。采用LC-MS分析,從RKBC提取物中共鑒定化合物15個,主要為原花青素類、花色苷類及黃酮醇類成分;從RKBK提取物中共鑒定化合物5個,主要為大豆皂苷類。結(jié)果表明,RKBC和RKBK提取物具有相似的初級代謝物,但次級代謝物存在很大的差異。原花青素,黃酮醇類成分和花色苷類成分是RKBC提取物的主要成分,大豆皂甙則為RKBK提取物的主要成分。(2)RKBC提取物對B16-F10細胞抑制作用的IC_(50)為36.93±2.74μg/mL,說明對B16-F10細胞具有明顯的抑制作用;而RKBK提取物在6.25-200μg/mL的濃度范圍內(nèi)對B16-F10細胞無明顯抑制作用。此外,RKBC提取物還可以濃度依賴性抑制細胞遷移,誘導G1期和G2/M期阻滯,并引發(fā)細胞凋亡和空泡化。細胞代謝組學結(jié)果表明RKBC提取物的抗黑色素瘤作用可能與嘌呤代謝有關。網(wǎng)絡藥理學結(jié)果顯示RKBC可能通過調(diào)節(jié)CDK2和CDK4影響細胞周期。Western Blot分析發(fā)現(xiàn)RKBC可降低AKT1/2/3和cleaved-MMP2的水平,并上調(diào)Bcl-xl的表達。(3)EA、BU、W和PE四個部位均能抑制B16-F10細胞增殖,EA、BU和W在6.25-100μg/mL的濃度范圍內(nèi)的IC_(50)分別為12.57±0.95μg/mL、11.71±4.44μg/mL、32.80±4.58μg/mL,而PE部位在此范圍的最大抑制率僅為35%。從IC_(50)值可以看出BU抑制B16-F10細胞增殖的活性最強,其次是EA、W和PE。細胞遷移、細胞凋亡、AO/EB和Hoechst 33342染色試驗結(jié)果顯示,BU部位在抑制細胞遷移和誘導細胞程序性死亡方面作用較強。活性部位定性分析結(jié)果顯示,EA、BU和W的化學組成存在顯著差異。EA部位以金絲桃苷和槲皮素為主,BU部位以保留時間為9.09 min的色譜峰和金絲桃苷為主,W部位以保留時間為2.63min和9.09 min的色譜峰為主。此外,保留時間為9.09 min的色譜峰通過液質(zhì)聯(lián)用分析推測為以槲皮素為母核的黃酮類成分,但具體結(jié)構(gòu)未定。定量分析結(jié)果顯示,EA、BU和W三個部位中金絲桃苷含量分別為3.534±0.055、1.716±0.008、0.930±0.003μg/μL,槲皮素含量分別為2.839±0.009、0.811±0.008、0.264±0.010μg/μL;總花色苷含量分別為0.374、0.227、0.107 mg/g。(4)Western blot分析顯示BU部位對與細胞程序性死亡調(diào)控相關的AKT1/2/3,p-AKT1/2/3,PARP,Bim和Bcl-xl均有一定作用,說明BU部位可能通過影響AKT1/2/3-Bim通路和上調(diào)Bcl-xl的表達促進B16-F10細胞的程序性死亡。金絲桃苷、槲皮素和山柰酚的抗黑色素瘤活性結(jié)果顯示,槲皮素(IC_(50)為17.88±1.28μg/mL)的抗黑色素瘤活性最強,山柰酚次之,金絲桃苷最弱。Western blot的結(jié)果顯示槲皮素對細胞程序性死亡的機制與BU部位相同。結(jié)論:本文通過NMR結(jié)合LC-MS分析,共鑒定出紅蕓豆提取物的55種化合物。發(fā)現(xiàn)RKBC提取物和RKBK提取物具有相似的初級代謝物,但次級代謝物存在顯著差異。采用小鼠黑色素瘤細胞B16-F10模型證明紅蕓豆皮具有顯著的抗黑色素瘤活性,而去皮種子無明顯作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)RKBC提取物發(fā)揮抗黑色素瘤作用可能通過抑制AKT1/2/3-MMP2通路從而抑制細胞遷移,抑制CDK2和CDK4的表達阻滯細胞周期,激活cGMP-PKG通路促進細胞凋亡,上調(diào)Bcl-xl的表達促進細胞空泡化等途徑實現(xiàn)。進一步的活性部位篩選實驗發(fā)現(xiàn)BU部位具有較強的抗黑色素瘤作用,其對細胞程序性死亡機制在于影響AKT1/2/3-Bim通路和上調(diào)Bcl-xl的表達誘導細胞程序性死亡進而抑制細胞增殖。BU中含有的槲皮素可能為RKBC提取物抑制黑色素瘤細胞增殖的主要活性成分之一。以上研究結(jié)果初步闡明紅蕓豆提取物抑制黑色素瘤細胞的活性成分和作用機制,為基于紅蕓豆的黑色素瘤治療藥物或功能食品研發(fā)奠定了基礎。
【學位單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：
紅蕓豆抗黑色素瘤活性成分及機制研究本研究擬以山西特產(chǎn)紅蕓豆為研究對象，以 B16-F10 小鼠黑色素瘤細胞為模過 NMR 及 LC-MS 技術對紅蕓豆皮和去皮種子提取物的化學成分進行研究，者化學成分差異。然后，進 步采用常規(guī)細胞實驗，如 MTT 法檢測細胞存活胞創(chuàng)傷愈合試驗、細胞凋亡檢測、細胞周期檢測等，并綜合運用代謝組學、理學等多學科技術，分析其抗黑色素瘤的作用機制。將紅蕓豆皮進 步分離的萃取部位，分析其對 B16-F10 小鼠黑色素瘤細胞的存活率、細胞遷移、細的影響，明確紅蕓豆皮抗黑色素瘤活性部位；采用液質(zhì)聯(lián)用、結(jié)合標準品對效液相和 pH 示差法對活性部位定性、定量分析。最后，通過 Western blot 確部位對細胞程序性死亡相關蛋白的作用及作用通路。對活性部位中的單體進存活率、細胞凋亡的藥效評價，選擇活性最佳的單體進行細胞程序性死亡相的驗證。
3.2 紅蕓豆提取物的 TIC 圖。（A）RKBC 提取物負離子模式的 TIC 圖；（B）RKBC 提取物正子模式的 TIC 圖；（C）RKBK 提取物負離子模式的 TIC 圖；（D）RKBK 提取物正離子模式 TIC 圖。.5 本章小結(jié)本章對紅蕓豆提取物進行化學成分分析，共指認 49 個化合物。通過1H-NMR
1 RKBC 和 RKBK 提取物的抗增殖作用和不同濃度 RKBC 對 B16-F10 細胞的使用 MTT 法檢測的 RKBC 提取物對 B16-F10 細胞的細胞活力的影響。用 R胞 24 h，數(shù)據(jù)來自三個獨立的實驗并呈現(xiàn)為吸光度。（B）MTT 法檢測的 R-F10 細胞活力的影響。用 RKBK 提取物處理細胞 24 h。數(shù)據(jù)來自三個獨立的度。*P≤0.05，**P≤0.01 且***P≤0.001。（C）細胞創(chuàng)傷愈合試驗。給藥孵育鏡拍攝的圖像。
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本文編號：
2850989
