背景:生脈方,包括生脈散、生脈飲、生脈注射液等中藥制劑,臨床上廣泛應用于慢性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、病毒性心肌炎等疾病的治療。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),OATP1B1/1B3介導了生脈方中主要效應組分麥冬皂苷D與人參皂苷Rb1/Rd的相互作用。�；悄懰徕c共轉運多肽(NTCP)也是一種非常重要的肝臟攝取轉運體,可介導許多內源性和外源性物質的跨膜轉運,在藥物的吸收、分布、排泄過程中發(fā)揮重要作用,近年來基于NTCP介導的藥物-藥物間相互作用也引起廣大學者的高度關注。目的:采用穩(wěn)定表達NTCP的HEK293T細胞模型,深入研究生脈方主要效應組分對NTCP轉運功能的影響及其基于NTCP介導的相互作用及其配伍機制,為生脈方的臨床安全合理應用進一步提供實驗依據(jù)。方法:1.建立�；悄懰徕c(TCNa)、人參皂苷Rb1、Rd、Rg1、Re、麥冬皂苷D、麥冬皂苷Dˊ、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙在HEK293T細胞中的LC-MS檢測方法。2.考察梯度攝取時間和藥物濃度對TCNa在NTCP-HEK293T細胞中攝取的影響,探索TCNa在NTCP-HEK293T細胞中的最佳攝取條件。3.考察生脈方主要效應部位及效應成分對NTCP-HEK293T細胞中TCNa的轉運影響,通過Graphpad Prisms計算其各自的IC_(50)值,并探索其影響機制。4.考察生脈方主要效應組分在NTCP-HEK293T細胞中的攝取情況及其攝取動力學,計算相應的動力學參數(shù)V_(max)和K_m值。5.考察生脈方中主要復雜組分間經NTCP介導的相互作用,探索其可能的配伍機制。結果:1.本實驗建立的TCNa、人參皂苷Rb1、Rd、Rg1、Re、麥冬皂苷D、麥冬皂苷Dˊ、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲和五味子醇乙的LC-MS定量分析方法特異性、精密度和準確度均較好,符合相關要求。2.在NTCP-HEK293T細胞中,TCNa的酶動力學參數(shù)K_m與V_(max)分別為9.41±1.22μM和342.63±17.36 pmol/mg protein/min。3.生脈方主要效應部位人參總皂苷、麥冬總皂苷、麥冬總黃酮、五味子總木脂素對NTCP-HEK293T細胞中TCNa的攝取有明顯的抑制作用,在50μM其抑制率分別為44%、29%、49%和43%;12種主要效應成分中僅有人參皂苷Rg1、麥冬皂苷Dˊ和五味子甲素對TCNa的攝取有明顯的抑制作用,在100μM其抑制率分別為58%、73%和69%。其中麥冬皂苷Dˊ對NTCP抑制作用較強,其IC_(50)值為6.71±0.70μM,而人參皂苷Rg1和五味子甲素抑制效果相對較弱,IC_(50)值分別為50.49±4.24μM和45.80±3.10μM。人參皂苷Rg1和麥冬皂苷Dˊ可能是通過非競爭性抑制模式來抑制TCNa的攝取,其V_(max)值分別從357.90±19.68pmol/mg protein/min減少至267.13±16.78 pmol/mg protein/min及從357.90±19.68 pmol/mg protein/min減少至212.13±13.77 pmol/mg protein/min,而K_m值幾乎不變。五味子甲素則可能通過混合型抑制模式來抑制TCNa的攝取,其K_m值從10.09±1.46μM增加至15.52±2.31μM而V_(max)值從357.90±19.68pmol/mg protein/min減少至308.86±21.89 pmol/mg protein/min。4.生脈方12種主要效應成分中僅有人參皂苷Re和五味子乙素可能是NTCP的底物,可以經NTCP攝取轉運,其攝取動力學參數(shù)K_m(μM)分別為47.13±2.73和82.43±11.36,V_(max)(pmol/mg protein/min)分別18.61±1.49和32.62±2.65;且它們在NTCP-HEK293T細胞中的攝取可以被經典抑制劑環(huán)孢菌素A明顯抑制。5.麥冬總皂苷、麥冬總黃酮、五味子總木脂素、人參皂苷Rg1、麥冬皂苷Dˊ和五味子甲素對人參皂苷Re在NTCP-HEK293T細胞中的攝取有明顯的抑制作用,在50μM抑制率分別為78%、95%、96%、36%、58%和49%。人參總皂苷、麥冬總皂苷、麥冬總黃酮和麥冬皂苷Dˊ對五味子乙素在NTCP-HEK293T細胞中的攝取有明顯的抑制作用,在50μM抑制率分別為42%、41%、43%和39%,而人參皂苷Rg1和五味子甲素則對五味子乙素在NTCP-HEK293T細胞中的攝取無影響。結論:1.生脈方中主要效應部位人參總皂苷、麥冬總皂苷、麥冬總黃酮、五味子總木脂素及其主要效應成分人參皂苷Rg1、麥冬皂苷Dˊ、五味子甲素可不同程度地抑制NTCP介導的TCNa的攝取,是NTCP潛在的抑制劑,可能與臨床藥物發(fā)生基于NTCP介導的相互作用。2.人參皂苷Re和五味子乙素是NTCP潛在的底物,它們經NTCP介導的轉運可被經典抑制劑環(huán)孢菌素A所抑制。3.生脈方中麥冬總皂苷、麥冬總黃酮、五味子總木脂素、人參皂苷Rg1、麥冬皂苷Dˊ和五味子甲素對NTCP介導的人參皂苷Re的攝取有不同程度的抑制作用;人參總皂苷、麥冬總皂苷、麥冬總黃酮和麥冬皂苷Dˊ對NTCP介導的五味子乙素的攝取有不同程度的抑制作用;生脈方主要復雜組分間存在基于NTCP介導的相互作用及配伍機制。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R289.5
【文章目錄】：
摘要
abstract
中英文縮略詞表
第1章 引言
第2章 生脈方主要效應組分對NTCP轉運功能的影響
    2.1 材料
        2.1.1 細胞株
        2.1.2 主要藥品與試劑
        2.1.3 主要儀器與設備
    2.2 方法
        2.2.1 主要工作液的配制
        2.2.2 細胞培養(yǎng)方法及生長曲線繪制
        2.2.3 藥物對NTCP-HEK293T細胞毒性的測定
        2.2.4 細胞樣品中蛋白的含量測定
        2.2.5 細胞樣品中TCNa的濃度測定
        2.2.6 NTCP-HEK293T細胞中TCNa攝取條件的探索
        2.2.7 生脈方中主要效應組分對NTCP攝取TCNa的影響研究
        2.2.8 Rg1、OPDˊ和SchA對 NTCP攝取TCNa的抑制機制研究
        2.2.9 統(tǒng)計分析
    2.3 結果
        2.3.1 NTCP-HEK293T細胞培養(yǎng)與生長曲線
        2.3.2 藥物對NTCP-HEK293T細胞毒性的評價結果
        2.3.3 細胞樣品蛋白的含量測定結果
        2.3.4 細胞樣品中TCNa濃度測定的方法學評價結果
        2.3.5 NTCP-HEK293T細胞中TCNa攝取條件評價結果
        2.3.6 生脈方中主要效應組分對NTCP攝取TCNa的影響研究
        2.3.7 Rg1、OPDˊ和SchA對 NTCP攝取TCNa的抑制機制
    2.4 討論
第3章 生脈方主要效應組分經NTCP的攝取及其相互作用研究
    3.1 材料
        3.1.1 細胞株
        3.1.2 主要藥品與試劑
        3.1.3 主要儀器與設備
    3.2 方法
        3.2.1 主要工作液的配制
        3.2.2 NTCP-HEK293T細胞培養(yǎng)方法及其生長曲線的繪制
        3.2.3 藥物對NTCP-HEK293T細胞毒性的測定
        3.2.4 細胞樣品蛋白的含量測定
        3.2.5 生脈方中12 種效應成分在細胞樣品中的濃度測定
        3.2.6 生脈方中主要效應成分經NTCP介導的攝取研究
        3.2.7 生脈方中主要效應組分間經NTCP介導的相互作用研究
        3.2.8 統(tǒng)計分析
    3.3 結果
        3.3.1 NTCP-HEK293T細胞培養(yǎng)與生長曲線
        3.3.2 藥物對NTCP-HEK293T細胞毒性的評價結果
        3.3.3 生脈方12 種主要效應成分檢測的方法學評價結果
        3.3.4 生脈方中主要效應成分經NTCP介導的攝取情況
        3.3.5 生脈方主要效應組分間經NTCP介導的相互作用
    3.4 討論
第4章 結論與展望
    4.1 結論
    4.2 展望
致謝
參考文獻
攻讀學位期間的研究成果
綜述
    參考文獻

【參考文獻】

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本文編號：2850272