第一部分南蛇藤素對CYPs的誘導作用的研究目的南蛇藤素(celastrol)是中藥雷公藤(Tripterygium Wilfordii.Hook.f.)等的主要活性成分之一,在臨床上可能與其他藥物聯(lián)用治療類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。為探討南蛇藤素是否可能與聯(lián)用的藥物發(fā)生基于藥物代謝的藥藥相互作用(DDI),本研究考察了南蛇藤素對大鼠原代肝細胞內(nèi)細胞色素P450(Cytochrome P450,CYPs)的表達調(diào)節(jié)作用。方法兩步膠原酶灌注法提取Wistar大鼠原代肝細胞,培養(yǎng)12h后用南蛇藤素處理。采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測南蛇藤素處理后大鼠原代肝細胞內(nèi)CYPs的mRNA的變化,采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測蛋白的表達變化,采用LC/MS/MS檢測S9體外代謝CYP2C、2D和3A的特異性底物生成4-羥基雙氯芬酸、1-羥基丁呋洛爾和6β-羥基睪酮的速率變化來考察酶活性變化情況。數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果1、南蛇藤素能夠明顯誘導大鼠原代肝細胞內(nèi)在藥物代謝中發(fā)揮主要作用的CYP2C、CYP2D 和 CYP3A 家族成員的表達。CYP2C12,CYP2D2,CYP3A1 和 CYP3A9mRNA 的表達被顯著誘導,而對CYP2C7和CYP2C11的mRNA水平無顯著影響。該誘導作用也反映在蛋白水平的變化上。2、南蛇藤素作用于大鼠原代肝細胞后,CYP2C、CYP2D和CYP3A的酶活性也升高。結(jié)論南蛇藤素能夠誘導大鼠原代肝細胞內(nèi)在藥物代謝中發(fā)揮主要作用的CYP2C、2D和3A的表達和酶活性。當與雷公藤制劑同服的藥物受上述三個家族成員代謝時,可能會發(fā)生基于代謝酶誘導的DDI,導致同服藥物的代謝清除加快并影響藥效。第二部分南蛇藤素對CYPs誘導作用的調(diào)控機制研究目的南蛇藤素對大鼠原代肝細胞內(nèi)多種CYPs有誘導作用,探討南蛇藤素誘導CYPs的作用機制,可為南蛇藤素的合理使用提供理論依據(jù)。研究表明核受體PXR和CAR及轉(zhuǎn)錄因子p53和NF-κB能夠調(diào)控CYPs的表達。因此,本研究將從核受體、p53和NF-κB三個方面入手,考察南蛇藤素對CYPs的誘導機制。方法兩步膠原酶灌注法提取大鼠原代肝細胞,培養(yǎng)12h后用南蛇藤素處理,采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測南蛇藤素處理大鼠原代肝細胞后,核受體PXR和CAR的mRNA和蛋白表達情況進行分析,并對PXR和CAR下游基因P-gp mRNA的變化進行檢測以分析上述核受體的功能。采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測p53、IκBα和NF-κB蛋白的表達情況,并結(jié)合特異性抑制劑考察受南蛇藤素影響的轉(zhuǎn)錄因子被抑制后,南蛇藤素對大鼠原代肝細胞內(nèi)CYPs的mRNA誘導的變化情況。數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism 5軟件進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果1、南蛇藤素作用后,大鼠原代肝細胞內(nèi)CAR和PXR的mRNA和蛋白質(zhì)并未被誘導,進一步對其活性進行分析發(fā)現(xiàn)其下游基因P-gp的mRNA發(fā)生了下調(diào)。該結(jié)果表明核受體CAR和PXR的活性可能被南蛇藤素抑制,提示上述核受體并未參與南蛇藤素對CYPs的誘導。2、南蛇藤素對p53的蛋白水平無顯著影響。該結(jié)果表明南蛇藤素可能不通過p53誘導CYPs表達。3、南蛇藤素能夠明顯抑制NF-κB蛋白的表達,呈一定的劑量依賴性。南蛇藤素與NF-κB抑制劑共同處理大鼠原代肝細胞后,南蛇藤素對CYP2C12,CYP2D2和CYP3A1 mRNA的誘導作用受到了抑制。結(jié)論南蛇藤素對CYPs的誘導作用機制可能至少部分是通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達,從而解除了 NF-κB對CYPs的抑制作用。核受體PXR和CAR以及轉(zhuǎn)錄因子p53可能在該過程中不發(fā)揮作用。第三部分南蛇藤素誘導CYPs在炎癥中的作用目的CYP2C能將花生四烯酸(AA)轉(zhuǎn)化為環(huán)氧二十碳三烯酸(EET),具有抗炎作用,而炎癥中CYP2C下調(diào)。本研究前兩部分研究結(jié)果表明南蛇藤素可誘導的CYP2C的活性。該結(jié)果提示南蛇藤素對CYP2C的誘導可能在其抗炎活性中發(fā)揮作用。因此,本部分擬考察南蛇藤素對CYPs的誘導作用是否參與了其抗炎機制。方法兩步膠原酶灌注法提取大鼠原代肝細胞,培養(yǎng)12 h后藥物處理。LPS處理大鼠原代肝細胞后,用SRB法檢測細胞生存率的改變,結(jié)合ELISA法檢測TNF-α和IFN-γ分泌的變化,考察炎癥誘導情況。在CYPs聯(lián)合南蛇藤素共同處理LPS誘導的大鼠原代肝細胞,ELISA法檢測TNF-α和IFN-γ的分泌變化。結(jié)果1、5μg/mlLPS可在大鼠原代肝細胞水平誘導炎癥反應。2、在大鼠原代肝細胞中,南蛇藤素與CYPs抑制劑共同處理與南蛇藤素單獨處理相比,LPS誘導的大鼠原代肝細胞中TNF-α和IFN-γ的分泌并無明顯變化。該結(jié)果表明抑制南蛇藤素誘導的CYPs對南蛇藤素抗炎活性沒有影響,提示南蛇藤素誘導的CYPs可能不參與南蛇藤素的抗炎活性。結(jié)論南蛇藤素誘導的CYPs可能不參與南蛇藤素的抗炎作用。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

２２?揚州大學碩士學位論文???ＣＹＰｓ?的表達（圖?１）：?ＣＹＰ２Ｃ１２?為?８．３８?和?２７．７０?（圖?１Ａ），?ＣＹＰ２Ｄ２?為?１３．３８?和?３９．９７?（圖??１?Ｂ），?ＣＹＰ３Ａ１?為?６．９３?和?５６．２０?（圖?１?Ｃ）和?ＣＹＰ３Ａ９?為?２．７０?和?２．２３?（圖?１?Ｄ）。??

圖１南蛇藤素處理大鼠原代肝細胞４８?ｈ后，ＣＹＰ２Ｃ１２?（Ａ），?ＣＹＰ２Ｄ２?（Ｂ），?ＣＹＰ３Ａ１?（Ｃ）和ＣＹＰ３Ａ９?（Ｄ）??的?ｍＲＮＡ?水平變化的情況。ｎ?＝?３，?＊＊尸＜０．０１，?＊＊＊Ｐ＜０．００１?ｖｓ?ｃｏｎｔｒｌ?組。??但南蛇藤素對ＣＹＰ２Ｃ７和ＣＹＰ２Ｃ１１的ｍＲＮＡ水平均無顯著影響（圖２）。以上結(jié)果提??示南蛇藤素作用于大鼠原代肝細胞后，能夠顯著誘導細胞內(nèi)的ＣＹＰ２Ｃ１２、２Ｄ２、３Ａ１和３Ａ９??ｍＲＮＡ的表達。??

而其它抗體識別大鼠ＣＹＰｓ的特異性較差，因此本部分僅對大鼠的ＣＹＰ３Ａ的表??達進行了分析。南蛇藤素處理大鼠原代肝細胞４８?ｈ后，裂解細胞提取總蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ??結(jié)果如圖３所示。南蛇藤素能夠顯著誘導ＣＹＰ３Ａ的表達，２．５?和５?ｎＭ濃度下的誘導??倍數(shù)分別為１．８６和１．４４。２．５?ｎＭ濃度下的誘導作用更強可能是因為南蛇藤素在５?｜ｉＭ的濃??度下有細胞毒作用，可能導致了胞內(nèi)蛋白的降解。上述結(jié)果表明南蛇藤素對大鼠原代肝細??胞內(nèi)ＣＹＰ３Ａ蛋白的表達有顯著誘導作用，與其誘導ｍＲＮＡ的趨勢一致。??Ｂ??２．５－１??Ｃｅｌ?ＯＥＸＡ?ｆＪ?Ｊ＿??ＭＭ?〇?２５?５?＿?１〇?！，，?憂丄?４??ＣＹＰ３Ａ?丨一１１０?＾?■??ｇａｐｄｈ?ｐｍａｐ?轉(zhuǎn)｜?ｈ?：?Ｂ??Ｉ．＿＿Ｉ??／?／?／，??Ｏ?。合。??圖３南蛇藤素處理大鼠原代肝細胞４８ｈ后，ＣＹＰ３Ａ的蛋白水平變化（Ａ）和ＣＹＰ３Ａ蛋白條帶灰度值??分析結(jié)果（Ｂ）。ｎ＝３，無ｔｓ．?＊Ｐ＜０．０５，＊＊尸＜０．０１ｖｓｃｅｌ〇ｎＭ?組。??
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本文編號：2850270