柑橘(Citrus)是世界種植范圍最廣的果樹(shù),種質(zhì)資源豐富,主要有寬皮柑橘(Citrus reticulata)、甜橙(Citrus sinensis)、檸檬(Citrus limon)、柚類(Citrus grandis)、葡萄柚(Citrus paradisi)、枸櫞(Citrus medica)等。柑橘果實(shí)集藥食兩用于一身,含多種生物活性成分,包含酚酸、類黃酮、類胡蘿卜素和類檸檬苦素等,具有抗氧化、緩解肥胖、預(yù)防和治療癌癥等功效。研究表明,柑橘果皮中化學(xué)成分的種類和含量普遍高于果肉,因此,分析研究柑橘果皮的化學(xué)成分對(duì)于開(kāi)發(fā)其藥用價(jià)值具有重要意義。本文主要基于超高效液相色譜聯(lián)用四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-QTof-MS)和Progenesis QI代謝組學(xué)軟件對(duì)寬皮柑橘(Citrus reticulata)和甜橙(Citrus sinensis)的果皮進(jìn)行了多甲氧基類黃酮(Polymethoxylated flavonoids,PMFs)測(cè)定、非靶向代謝輪廓分析、體外抗氧化活性評(píng)價(jià)、代謝組學(xué)四方面的研究,主要內(nèi)容如下:1基于UPLC-QTof-MS簡(jiǎn)單快速測(cè)定寬皮柑橘和甜橙果皮中的PMFs PMFs是指在黃酮母核上含4個(gè)及以上甲氧基的一類天然產(chǎn)物,是柑橘屬果實(shí)含有的一類特殊的類黃酮,比普通的類黃酮具有更強(qiáng)的抗癌效果。本節(jié)利用超高效液相色譜聯(lián)用高分辨質(zhì)譜建立了一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的方法對(duì)寬皮柑橘和橙果皮的甲醇提取物中的PMFs進(jìn)行了定性與定量分析。方法學(xué)驗(yàn)證顯示該方法穩(wěn)定可靠,適合用于柑橘中PMFs的分析。主要結(jié)果如下:(1)通過(guò)MS~E技術(shù),分析PMFs的二級(jí)質(zhì)譜碎片,與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品和文獻(xiàn)中譜圖比較后,在14種柑橘果實(shí)中共鑒定出42種PMFs,其中33種為多甲氧基黃酮,9種為多甲氧基黃烷酮。(2)同時(shí)對(duì)其中的13種多甲氧基黃酮進(jìn)行了含量測(cè)定。其中Nobiletin,Sinensetin,Tangerin和3,5,6,7,8,3,4’-Heptamethoxyflavone含量較高,寬皮柑橘中PMFs的種類和含量普遍較橙類中高。(3)檢測(cè)限和定量限分別為75pg/mL和0.25 ng/mL,線性范圍0.500-1000ng/mL,相關(guān)系數(shù)均在0.995以上�；厥章史秶�94.52%-105.57%,日間和日內(nèi)重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于2.79%和5.43%。2寬皮柑橘和橙果皮的化學(xué)成分和體外抗氧化活性研究柑橘中含多種活性成分,主要有類黃酮、酚酸、類檸檬苦素、類胡蘿卜素等。本節(jié)主要基于UPLC-QTof-MS對(duì)10種寬皮柑橘和6種橙類果皮的甲醇提取物進(jìn)行了系統(tǒng)的分析鑒定,歸納總結(jié)了黃酮類化合物的質(zhì)譜裂解行為,并用ABTS法、DPPH法和FRAP法評(píng)價(jià)了這16種柑橘的體外抗氧化活性,將活性與化學(xué)成分進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。主要結(jié)果如下:(1)在16種柑橘果皮中共檢出92種化學(xué)成分,包括4種黃酮苷元、22種多甲氧基黃酮、10種多甲氧基黃烷酮/查爾酮、33種黃酮苷,9種�；S酮苷和8種類檸檬苦素、3種香豆素苷類以及3種其它類型的化合物�；衔锏姆N類分布大致是野生寬皮柑橘多于栽培寬皮柑橘多于橙類。莽山橘和細(xì)皮狗屎柑所含化合物種類較多,分別為84和82種,S26錦橙和長(zhǎng)葉橙最少為46種。(2)抗氧化活性綜合指數(shù)(Antioxidant Potency Composite,APC)綜合三種方法評(píng)價(jià)柑橘總的體外抗氧化能力,岑溪酸橘果皮的抗氧化能力最強(qiáng),莽山橘排第二,二者均屬于野生寬皮柑橘。最弱的為先鋒橙,其次是S26錦橙,二者均屬橙類�？傮w來(lái)看寬皮柑橘較橙類的抗氧化能力強(qiáng),野生寬皮柑橘較栽培寬皮柑橘抗氧化能力強(qiáng)。(3)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,正離子模式下共有8種化合物與抗氧化能力呈極顯著相關(guān)。其中主要影響ABTS法抗氧化能力的化合物是Natsudaidain-3-O-HMG-glucoside,與DPPH法抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)的化合物為Caffeicacyl-hydroxyl-methoxylflavanone-O-diglycoside,與FRAP法抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)的化合物有7個(gè),依次為Caffeicacyl-hydroxyl-methoxylflavanone-O-diglycoside;Dihydroxy-flavone-dimethoxyflavone-O-glucoside;5,7,4’-Trimethoxyflavone;(2R)-Hesperidin;Swertisin-5-O-β-D-glucoside;5,7,3’,4’-Tetramethoxyflavone-6-O-β-D-glucoside;1-Feruloyl-β-D-glucopyranoside。負(fù)離子模式下,共有9個(gè)化合物與抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)。其中與ABTS法呈極顯著正相關(guān)的化合物有Natsudaidain-3-O-(HMG)-glucoside和Isopyrenin,影響FRAP法抗氧化能力的化合物有7個(gè),分別為Caffeicacyl-hydroxyl-methoxylflavanone-O-diglycoside;5,7,3’,4’-Tetramethoxy-flavone-6-O-β-D-glucoside;Dihydroxyflavone-dimethoxyflavone-O-glucoside;Tricin-5-glucoside/Tricin-7-glucoside;(2R)-Hesperidin;Swertisin-5-O-β-D-glucoside;Hesperetin-7-O-glucoside。3寬皮柑橘和橙果皮提取物的代謝組學(xué)鑒別分析代謝組學(xué)是研究生物體系(細(xì)胞、組織或生物體)受外部刺激后所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物變化的一種研究方法。本節(jié)利用UPLC-QTof-MS結(jié)合Progenesis QI對(duì)寬皮柑橘和橙兩類柑橘果皮進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析,尋找不同種類柑橘的代謝差異物。主要結(jié)果如下:(1)使用UPLC-QTof-MS平臺(tái)采集10種寬皮柑橘和6種橙類果皮代謝輪廓圖譜,質(zhì)量控制(Quality Control,QC)樣品用于評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。正離子模式下RSD≦30%的峰個(gè)數(shù)占整個(gè)數(shù)據(jù)的91.34%,負(fù)離子模式下RSD≦30%的峰個(gè)數(shù)占整個(gè)數(shù)據(jù)的88.79%,主成分分析(PCA)中QC樣本聚集程度良好,證明數(shù)據(jù)采集方法可靠,系統(tǒng)穩(wěn)定。(2)在多元統(tǒng)計(jì)分析中,使用主成分分析(PCA)這種無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別觀察所有樣本的分散與聚集程度。正離子模式下,R~2X[1]=0.5051,R~2X[1]=0.1519,第一主成分和第二主成分共解釋原變量的65%,且寬皮柑橘和橙類在第一主成分上即可得到分離,無(wú)離異樣本。在正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)中,兩組樣品在第一主成分得到完全分離,R~2Y=99%,Q~2=90%,證明模型具有良好的解釋性和預(yù)測(cè)性,所得數(shù)據(jù)可靠。通過(guò)重要變量投影(VIP)和S-Plot圖可篩選潛在生物標(biāo)志物,5條標(biāo)準(zhǔn)為:OPLS-DA模型中變量重要性投影指標(biāo)(VIP)1,|p|0.1,倍數(shù)變化(Fold Change,FC)2,Anova(p)0.05和相關(guān)系數(shù)|p(corr)|0.5作為篩選條件,得可用于鑒別寬皮柑橘和橙類的潛在標(biāo)志物有5個(gè)。同理可得負(fù)離子模式可用于鑒別寬皮柑橘和橙類的潛在標(biāo)志物有6個(gè)。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R284.1
【部分圖文】：

21圖 2-1 寬皮柑橘和橙類的基峰離子流圖（BPI）（A）蕉柑（C. reticulata）正離子模式下的基峰離子流圖；（B）8045 甜橙（C. sinensis）正離子模式下的基峰離子流圖；（C）13 種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的基峰離子流圖

圖 2-2 化合物 27 的 MSE掃描譜圖（A）低能量碰撞通道；（B）高能量碰撞通道對(duì)于多甲氧基黃烷酮來(lái)說(shuō)，優(yōu)先發(fā)生 C 環(huán)的 Retro-Diels-Alder (RDA)重排反應(yīng)：常從 C 環(huán)的 1, 3 或 1, 4 斷裂產(chǎn)生1,3or4A+and1,3or4B+離子，因此這些離子常常作為多甲氧基黃烷酮的基峰離子。其次，1,3A+或1,3B+還會(huì)發(fā)生 15 Da (CH3)、28Da (CO)、30 Da (2CH3) 和 33 Da (CH3+H2O)等中性丟失產(chǎn)生相應(yīng)的特征離子。判斷 3 位是否取代的關(guān)鍵離子為0or1, 2A+和0or1, 2B+。對(duì)于查爾酮來(lái)說(shuō)，基峰離子xB+和yA+及在基峰離子上中性丟失 15Da(CH3)、28 Da (CO)和 30 Da (2CH3)產(chǎn)生的響應(yīng)離子都是查爾酮的診斷離子。值得注意的是，查爾酮較易將電荷保留在 B 環(huán)，紫外最大吸收波長(zhǎng)在 330-370nm 范圍，而黃烷酮更傾向于將電荷保存在 A 環(huán)，最大吸收波長(zhǎng)在 320nm。以化合物 11 為例描述多甲氧基黃烷酮的鑒定過(guò)程：首先，從低能量通道（圖 2-3A）得化合物的準(zhǔn)分子離子峰 m/z375.1436，計(jì)算得分子式為C20H22O7，對(duì)比圖 2-1 可知該化合物為一個(gè)五甲氧基黃烷酮或五甲氧基查爾酮。高能量通道的二級(jí)碎片譜圖（圖 2-3B）中，基峰離子 m/z211.0601(1,3A+)和豐度次高占 26.42%的離子 m/z 196.0366 (1,3A+-CH3)則被認(rèn)為是多甲氧基黃烷酮的診斷離子，因此該化合物是一個(gè)五甲氧基黃烷酮。從低質(zhì)量區(qū)的 m/z 211.0601(1,3A+) 和 m/z

圖 2-3 化合物 11 的 MSE掃描譜圖（A）低能量碰撞通道；（B）高能量碰撞通道表 2-3 14 種柑橘中 42 種多甲氧基類黃酮分類表Peaks Amount Formula MW Classno. of -OHno. of–CH31 1 C17H14O6314 Dihydroxydimethoxyflavone 2 213 1 C19H20O7360 Monohydroxytetramethoxyflavanone 1 42,5,8,10,30,41 6 C19H18O7358 Monohydroxytetramethoxyflavone 1 43,4,7,15,36,38 6 C18H16O6328 Monohydroxytrimethoxyflavone 1 318,31 2 C20H22O8390 Monohydroxypentamethoxyflavanone 1 59,12,16,34 4 C20H20O8388 Monohydroxypentamethoxyflavone 1 511,23,37,42 4 C20H22O7374 Pentamethoxyflavanone 0 514,21,33 3 C20H20O7372 Pentamethoxyflavone 0 526,39 2 C21H24O8404 Hexamethoxyflavanone 0 66,17,32,40 4 C21H22O9418 Monohydroxyhexamethoxyflavone 1 619,22,28 3 C19H18O6342 Tetramethoxyflavone 0 420,25,27,35 4 C21H22O8402 Hexamethoxyflavone 0 629 1 C22H24O9432 Heptamethoxyflavone 0 725 1 C18H16O5312 Trimethoxyflavone 0 3基于以上鑒定規(guī)律，我們?cè)?7 種寬皮柑橘和 7 種橙類中共鑒定出 42 種多甲氧基類黃酮。其中 35 種是通過(guò)與文獻(xiàn)中比對(duì)確定的結(jié)構(gòu)，化合物 1,4,6,8,9,10,13 和化合物 37 首次在柑橘屬中發(fā)現(xiàn)（圖 2-5）。在 14 種柑橘中，寬皮柑橘多甲氧基黃
【參考文獻(xiàn)】

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1 許茹;鐘鳳林;吳德峰;;中藥青皮本草考證[J];中藥材;2013年06期

本文編號(hào)：2850030