目的:通過蛞蝓抗大鼠支氣管哮喘作用和對小鼠止咳化痰作用研究,探討其抗支氣管哮喘作用機制,篩選蛞蝓止咳化痰活性成分。建立以活性成分為指標的含量測定方法,為蛞蝓質量控制體系的建立及蛞蝓藥材的綜合利用提供實驗依據(jù)。方法:1.將40只SD大鼠隨機分為6組,每組8只,分別為正常組、模型組、地塞米松組、蛞蝓高劑量組、蛞蝓低劑量組。除正常組外,其余各組于實驗第1、8天腹腔注射10%OVA溶液1mL,第8天追加臀部皮下注射10%OVA溶液0.2mL致敏塑造支氣管哮喘大鼠模型,正常組注射等體積生理鹽水。第15天開始,將大鼠放于超聲霧化箱,超聲霧化噴入2%OVA生理鹽水10mL激發(fā)3周,每次霧化30min,每日一次,正常組用生理鹽水代替2%OVA,記錄哮喘潛伏期。激發(fā)前1h,給予藥物灌胃干預,給藥劑量分別為地塞米松組1mg·kg~(-1)、蛞蝓高劑量組92mg·kg~(-1)、蛞蝓低劑量組23mg·kg~(-1)、正常組給予同等體積生理鹽水(給藥體積0.01mL·g~(-1))。末次激發(fā)后,10%水合氯醛麻醉大鼠,按要求采集標本,采用ELISA法測定大鼠血清及BALF的LT、IL-4、IFN-γ含量;部分肺組織行病理切片,HE染色,觀察肺組織結構及炎癥浸潤;采用免疫組化法測PTEN蛋白表達含量;采用RT-PCR法測肺組織中PTEN mRNA含量;2.取48只昆明小鼠,分為6組,每組8只,分別為正常對照組、咳必清組、蛞蝓提取物高、低劑量組、多糖高、低劑量組,灌胃給藥,給藥劑量分別為咳必清50mg·kg~(-1)、蛞蝓提取物高劑量300mg·kg~(-1)、蛞蝓提取物低劑量100mg·kg~(-1)、多糖高劑量組200mg·kg~(-1)、多糖低劑量組50mg·kg~(-1)、正常組給予等體積生理鹽水。給藥5天后以20%氨氣引咳,記錄3min內小鼠咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù);取48只昆明小鼠,分組及給藥劑量同上,鹽酸氨溴索組給藥劑量為100mg·kg~(-1),給藥5天后腹腔注射5%酚紅,檢測小鼠氣管段酚紅排泌量,初步篩選蛞蝓止咳化痰活性成分;3.采用顯微鑒別法、薄層色譜法對蛞蝓藥材進行定性鑒別;參照2015年版《中國藥典》四部通則下“水分檢測法”、“灰分檢測法”、“浸出物檢測法”檢測不同產地蛞蝓水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物等相關項目;采用苯酚-硫酸比色法,對不同產地蛞蝓藥材多糖含量進行測定。結果:1.與模型組相比,地塞米松組、蛞蝓高劑量組均能延長大鼠哮喘潛伏期(P0.05);與正常組比較,模型組大鼠血清及BALF中LT、IL-4含量增加,IFN-γ含量減少(P0.05);與模型組比較,地塞米松組、蛞蝓提取物高組大鼠血清中LT、IL-4含量明顯下降,IFN-γ含量上升(P0.05);地塞米松組、蛞蝓提取物高、低劑量組大鼠BALF中LT、IL-4含量明顯下降,IFN-γ含量上升(P0.05);HE染色可見,正常組大鼠肺組織、支氣管上皮結構完整,管腔內無炎癥物質滲出,肺泡大小正常,無粘連,無炎性分泌物;模型組大鼠支氣管上皮可見明顯脫落壞死,支氣管壁增厚,支氣管周圍炎性浸潤嚴重,管腔變小,腔內炎癥物質聚集,肺泡壁粘連增厚,肺泡數(shù)減少,肺泡腔內可見炎性分泌物;地塞米松組、蛞蝓高和低劑量組支氣管壁輕度增厚,腔內炎性物質減少,支氣管上皮無脫落壞死,肺泡壁粘連減輕;大鼠肺組織支氣管PTEN蛋白表達免疫組織化學染色結果顯示,正常組大鼠肺組織支氣管周圍PTEN大量表達,地塞米松組,蛞蝓提取物高劑量組PTEN蛋白表達減少,蛞蝓低劑量組、模型組肺組織PTEN蛋白表達呈弱陽性;PCR結果顯示,與模型組相比,地塞米松組、蛞蝓高劑量組大鼠肺組織PTEN mRNA含量增多(P0.05)。2.與正常對照組相比,咳必清組、蛞蝓提取物組、多糖組小鼠咳嗽次數(shù)明顯減少、咳嗽潛伏期延長(P0.05);與正常對照組相比,鹽酸氨溴索組、多糖高劑量組小鼠酚紅排泌量明顯增加(P0.05);3.采用顯微鑒別、薄層鑒別法對不同產地的蛞蝓進行定性鑒別,結果顯示不同產地的蛞蝓性狀特征,斑點位置、顏色均大致相同;不同產地蛞蝓各項檢查項目符合規(guī)定;建立了采用UV法測定蛞蝓多糖含量測定方法,方法學考察結果顯示該方法精密度、穩(wěn)定性、重復性和加樣回收試驗均符合《中國藥典》相關標準。結論:1.通過建立支氣管哮喘大鼠模型,考察蛞蝓提取物對支氣管哮喘的治療作用,結果顯示蛞蝓提取物抗支氣管哮喘效果顯著,其作用機制可能與影響Th1/Th2細胞因子平衡,上調PTEN表達有關;2.蛞蝓具有明顯止咳化痰作用,初步確定蛞蝓的止咳化痰主要活性成分為多糖;3.建立了蛞蝓鑒別方法;制定了蛞蝓水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物的參考限量;建立了蛞蝓多糖含量測定方法。
【學位單位】：廣西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

取物對支氣管大鼠哮喘潛伏期的影響組相比，地塞米松組、蛞蝓高劑量組均能延.05）。見表 1-2。 1-2 蛞蝓提取物對支氣管哮喘大鼠哮喘潛伏期影響( x s劑量（mg·mL-1） 哮喘40.5 1 68.1組 23 49.2組 92 56.5組相比，▲P<0.05

（P<0.05）；地塞米松組、蛞蝓高、低劑量組 BALF 中 LT、IL-4 含量明顯下降，IFN-γ 含量上升（P<0.05）。見表 1-3、1-4。表 1-3 蛞蝓提取物對支氣管哮喘大鼠血清 LT、IL-4、IFN-γ 的影響( x s，n=8)分組 LT（ng·L-1） IL-4（ng·L-1） IFN-γ(ng·L-1) IFN-γ/IL-4正常組 31.39±6.28▲12.66±0.61▲165.43±20.21▲12.62±2.26▲模型組 39.31±5.43 14.64±0.55 130.66±4.66 9.93±0.86地塞米松組 33.56±1.09▲13.84±0.39▲173.95±19.07▲13.22±1.71▲蛞蝓低劑量組 32.24±2.87▲14.06±0.56 144.30±116.20 10.96±1.41蛞蝓高劑量組 31.69±1.76▲13.23±1.05▲173.27±38.42▲13.21±2.37▲注：與模型組相比，▲P<0.05

表 1-4 蛞蝓提取物對支氣管哮喘大鼠 BALF LT、IL-4、IFN-γ 的影響( x s，n=8)分組 LT（ng·L-1） IL-4（ng·L-1） IFN-γ(ng·L-1) IFN-γ/IL-4正常組 19.52±1.83▲10.58±0.67▲14.41±1.78▲1.35±0.09▲模型組 23.21±1.61 14.39±0.77 11.24±1.12 0.78±0.04地塞米松組 19.28±1.07▲10.51±0.81▲14.42±1.87▲1.37±0.08▲蛞蝓低劑量組 20.81±1.54▲9.32±1.07▲13.33±0.74▲1.44±0.09▲蛞蝓高劑量組 20.26±1.91▲10.43±1.02▲14.35±2.02▲2.08±0.77▲注：與模型組相比，▲P<0.05
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本文編號：2847294