動脈粥樣硬化(AS)是發(fā)生于動脈血管壁的慢性炎癥性疾病。細胞焦亡是新近發(fā)現(xiàn)并被證實的一種新型促炎癥性程序性細胞死亡方式,細胞焦亡發(fā)生的同時伴隨著白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)等炎癥因子的大量成熟與釋放,并誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)。研究表明,巨噬細胞焦亡在AS易損斑塊的形成、破裂及免疫炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色。NLRP3炎癥小體是介導(dǎo)細胞焦亡的重要調(diào)節(jié)器,調(diào)控NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的巨噬細胞焦亡有望成為穩(wěn)定AS易損斑塊的新策略。清心解瘀方由國醫(yī)大師陳可冀院士治療心肌梗死的經(jīng)驗方愈梗通瘀湯精簡化裁而來,具有益氣活血、化濁解毒之功效,是針對冠心病“瘀毒”病因病機的代表方。臨床研究表明清心解瘀方可降低穩(wěn)定性冠心病患者的心血管終點事件和血清炎癥因子水平,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究提示抗炎是其主要作用機制之一,蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示清心解瘀方可調(diào)控AS相關(guān)細胞的程序性死亡。然而,清心解瘀方在分子水平是否可通過抑制NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗炎作用?在細胞水平對焦亡這一促炎癥性程序性細胞死亡方式是否具有調(diào)控作用?在動物水平抗炎、穩(wěn)定AS易損斑塊的效應(yīng)機制如何?上述科學(xué)問題均有待深入探索和回答。基于此,我們提出如下科學(xué)假說:清心解瘀方可通過抑制NLRP3炎癥小體的活化、調(diào)控巨噬細胞焦亡的發(fā)生、減少炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放,從而發(fā)揮抗炎、穩(wěn)定AS易損斑塊的作用。圍繞上述假說,分別開展體內(nèi)實驗、體外實驗和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究三部分研究內(nèi)容,觀察清心解瘀方對AS易損斑塊的干預(yù)效應(yīng),探討干預(yù)效應(yīng)與巨噬細胞焦亡和NLRP3炎癥小體活化之間的關(guān)系,旨在從整體動物、細胞分子和生物網(wǎng)絡(luò)三個水平闡明清心解瘀方調(diào)控巨噬細胞焦亡、穩(wěn)定AS易損斑塊的效應(yīng)特點與作用機制。研究一清心解瘀方對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化易損斑塊的影響及機制研究目的:觀察清心解瘀方對ApoE-/-小鼠AS易損斑塊的影響,從NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的巨噬細胞焦亡角度探討其作用機制。方法:50只高脂飼料飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠隨機分為模型組、陽性對照組(阿托伐他汀,5mg/Kg/d)、清心解瘀方低劑量組(4.7g/Kg/d)、清心解瘀方中劑量組(9.4g/Kg/d)和清心解瘀方高劑量組(18.8 g/Kg/d),10只C57BL/6J小鼠作為正常對照組;灌胃給予相應(yīng)藥物8周;采用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等血脂指標水平;采用蘇丹Ⅳ大體染色、主動脈根部蘇木素-伊紅(HE)染色和Movat染色等病理形態(tài)學(xué)方法評估AS病變程度及斑塊穩(wěn)定性;采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)、IL-1β和IL-18等炎癥因子水平;采用免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)免疫印跡法(WB)檢測焦亡相關(guān)分子NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表達水平;采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法(qPCR)檢測焦亡相關(guān)分子NLRP3、Caspase-1和GSDMD mRNA表達水平。結(jié)果:血脂檢測顯示,與模型組比較,阿托伐他汀組、清心解瘀方低劑量、中劑量和高劑量組TC水平均顯著降低(P0.05),與模型組比較,阿托伐他汀組、清心解瘀方中劑量和高劑量組LDL-C水平均顯著降低(P0.05);蘇丹Ⅳ大體染色顯示,模型組主動脈斑塊最為明顯,阿托伐他汀組、清心解瘀方低劑量、中劑量和高劑量斑塊均有不同程度的減輕;HE染色顯示,與模型組比較,阿托伐他汀組、清心解瘀方中劑量和高劑量組主動脈根部斑塊比例均顯著降低(P0.05),阿托伐他汀組、清心解瘀方低劑量、中劑量和高劑量組斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量均顯著降低(P0.05);Movat染色顯示,與模型組比較,阿托伐他汀組和清心解瘀方高劑量組泡沫細胞含量均顯著降低(P0.05),阿托伐他汀組和清心解瘀方高劑量組膠原纖維含量均顯著升高(P0.05);ELISA實驗顯示,與模型組比較,阿托伐他汀組、清心解瘀方中劑量和高劑量組血清CRP、IL-1β、IL-18水平均顯著降低(P0.05);免疫組織化學(xué)和WB實驗顯示,與模型組比較,阿托伐他汀組、清心解瘀方中劑量和高劑量組NLRP3蛋白表達量均顯著降低(P0.05),阿托伐他汀組和清心解瘀方高劑量組Caspase-1蛋白表達量均顯著降低(P0.05),阿托伐他汀組和清心解瘀方高劑量組GSDMD-N蛋白表達量均顯著降低(P0.05);qPCR實驗顯示,與模型組比較,阿托伐他汀組和清心解瘀方高劑量組NLRP3mRNA表達量均顯著降低(P0.05),阿托伐他汀組、清心解瘀方中劑量組和高劑量組Caspase-1mRNA表達量均顯著降低(P0.05),阿托伐他汀組和清心解瘀方高劑量組GSDMD mRNA表達量均顯著降低(P0.05)。結(jié)論:清心解瘀方可降低ApoE-/-小鼠血脂和血清炎癥因子水平,改善機體脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng),減少主動脈斑塊內(nèi)巨噬細胞浸潤和脂質(zhì)沉積,改善斑塊局部炎癥微環(huán)境,從而穩(wěn)定AS易損斑塊,其機制可能與調(diào)控主動脈組織中NLRP3炎癥小體活化介導(dǎo)的巨噬細胞焦亡和炎癥級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。研究二清心解瘀方對J774A.1巨噬細胞焦亡的影響及機制研究目的:觀察清心解瘀方含藥血清對J774A.1巨噬細胞焦亡的影響,從NLRP3炎癥小體途徑探討其作用機制。方法:采用脂多糖(LPS)和三磷酸腺苷(ATP)聯(lián)合刺激的J774A.1巨噬細胞為焦亡細胞模型,分為模型組、陽性對照組(MCC950,50μM)和清心解瘀方組(8%清心解瘀方含藥血清),常規(guī)培養(yǎng)的J774A.1巨噬細胞作為空白對照組,給予相應(yīng)藥物干預(yù)24h;采用Hoechst33342/碘化丙錠(PI)雙染、吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)雙染、PI和7-氨基放線菌素D(7-AAD)分別標記的流式細胞術(shù)檢測J774A.1巨噬細胞焦亡水平;采用ELISA法檢測IL-11β和IL-18等炎癥因子水平;采用免疫熒光法和WB法檢測焦亡相關(guān)分子NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表達水平;采用qPCR法檢測焦亡相關(guān)分子NLRP3、Caspase-1和GSDMD mRNA表達水平。結(jié)果:Hoechst33342/PI雙染顯示,與模型組比較,MCC950組和清心解瘀方組PI陽性率均顯著降低(P0.05);AO/EB雙染顯示,與模型組比較,MCC950組和清心解瘀方組EB陽性率均顯著降低(P0.05);PI流式細胞術(shù)顯示,與模型組比較,MCC 950組和清心解瘀方組PI陽性率均顯著降低(P0.05);7-AAD流式細胞術(shù)顯示,與模型組比較,MCC950組和清心解瘀方組7-AAD陽性率均顯著降低(P0.05);ELISA實驗顯示,與模型組比較,MCC950組和清心解瘀方組IL-1β水平均顯著降低;免疫熒光和WB實驗顯示,與模型組比較,MCC950組和清心解瘀方組NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N蛋白表達量均顯著降低(P0.05);qPCR實驗顯示,與模型組比較,MCC 950組和清心解瘀方組NLRP3、Caspase-1和GSDMD mRNA表達量均顯著降低(P0.05)。結(jié)論:清心解瘀方含藥血清可調(diào)控LPS和ATP聯(lián)合誘導(dǎo)的J774A.1巨噬細胞焦亡,其機制與抑制NLRP3炎癥小體活化有關(guān)。研究三清心解瘀方抑制NLRP3炎癥小體活化的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究目的:應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索清心解瘀方抑制NLRP3炎癥小體活化的效應(yīng)特點和潛在生物學(xué)機制,為未來深入研究提供依據(jù)。方法:采用GEO數(shù)據(jù)庫公開發(fā)表的基因芯片信息篩選NLRP3炎癥小體活化的相關(guān)基因,采用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫篩選清心解瘀方藥物活性成分及靶基因信息,采用Cytoscape3.2.1軟件和STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建并分析清心解瘀方抑制NLRP3炎癥小體活化的“藥物-成分-靶基因”網(wǎng)絡(luò),采用FunRich3.1.3軟件進行靶基因功能富集分析。結(jié)果:清心解瘀方中的115種活性成分可通過作用于64個靶基因抑制NLRP3炎癥小體活化,其中來源于丹參和川芎的丹參新醌丙、丹參醌乙、γ-谷甾醇、丹參新酮Ⅰ、新隱丹參酮Ⅱ、次丹參醌、去氫丹參新酮、雌三醇等為主要藥效成分;靶基因功能富集分析顯示,清心解瘀方可通過調(diào)控能量通路、代謝、免疫反應(yīng)、脂肪酸代謝等10余個生物學(xué)過程,IL-1信號通路、IL-12信號通路、TNF信號通路、IFN-γ信號通路、AP-1信號通路、mTOR信號通路、ARF6信號通路、PI3K/Akt信號通路等20余條生物信號通路發(fā)揮抑制NLRP3炎癥小體活化的作用。結(jié)論:清心解瘀方抑制NLRP3炎癥小體活化具有多成分、多靶點、多途徑整合調(diào)節(jié)的效應(yīng)特點,未來可從不同生物信號通路與NLRP3炎癥小體的相互作用角度進一步探索清心解瘀方調(diào)控巨噬細胞焦亡的效應(yīng)機制。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

??ＧＳＤＭＤ蛋白在非經(jīng)典和經(jīng)典細胞焦亡途徑中的具體分子機制見圖１。??Ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ?Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ?Ｃａｎｏｎｉｃａｌ?Ｉｎｆｌａ巾ｍａｓｏｍｅｓ??．＇、Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ?〇?°?＾?Ｔｏｘｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ??ｂａｃｔｅｒｉａ?ＡＴＰ，?Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ?Ｓ．?Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ?ｄｓＤＮＡ?ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ??，?ｉ?ｏｆ?Ｒｈｏ?ＧＴＰａｓｅｓ??Ｓ?ｉ?ｉ?ｉ?Ｉ??￥?ＮＬＲＰ３?會?ＮＬＲＰ３?ＮＬＲＣ４?！?ＡＩＭ２?Ｐｙｒｉｎ??ｆ?［ｆｒ—?Ａ?Ａ?Ａ?ｎ??ｉ—ｉ?Ｌ＊ａ?Ｉ?１￣￣？?ｑ?＾￣Ｉ?１??Ｃａｓｐａｓｅ－４，５，１１?Ａｃｔｉｖｅ?Ｃａｓｐａｓｅ－１?Ａｃｔｉｖｅ?Ｃａｓｐａｓｅ－１??｜ｒ?｜ｆ?＾＾??Ｉ?ｌ?Ｉ?＼?Ｉ?＼?Ｉ?１??ＣＪＯ?ｃ＾」?０?０?ＣＵＤ?ｏ?ｏ??Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ?Ｄ?Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ?Ｐｒｏ－ＩＬ－１３?ＵＰ?Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ?Ｄ?Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ?Ｐｒｏ－ＩＬ－１３?ＩＬ－１３??ｉ?，?）?ｌ?＿—Ｉ??Ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ?Ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ??〇?〇?〇?〇??〇?〇??Ｆｉｇｕｒｅ?１?Ｔｈｅ?ｒｏｌｅ?ｏｆ?ＧＳＤＭＤ?ｉｎ?ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ?ｄｒｉｖｅｎ?ｂｙ?ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ?ａｎｄ?ｃａｎｏｎｉｃａｌ?ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｓ．??圖１?ＧＳＤＭＤ在非經(jīng)典和經(jīng)典細胞焦亡途徑中的分子機制??［引自?ＣｅＺ／ｒｅｒｅａｒｃ／！

激活ＮＬＲＰ３，?ＮＬＲＰ３進一步募集ＡＳＣ和ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１裝配形成具有活性的ＮＬＲＰ３炎??癥小體，活化的Ｃａｓｐａｓｅ－１進而催化加工ｐｒｏ－ＩＬ－ｉｐ和ＧＳＤＭＤ蛋白，誘導(dǎo)ＩＬ－ｌｐ的成熟、??釋放及細胞焦亡的發(fā)生（圖１）?［３０］。??■?Ｉ??Ｐｒｉｍｉｎｇ?１?ＮＬＲＰ３?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?１?Ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ?＆??ＩＬ－１ｐ?ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ??１?ｉ??ＰＡＭＰｓ?？?！??＆?廣?／?１?？?ｒ?，??ＤＡＭＰ１－?｜?Ａ?？?？?１??ｉ?＾?ｒ?＇Ｘ?；；；Ｖ??、ＮＬＲＰ３?＊?ｌ??Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ?．??Ｆｉｇｕｒｅ?１?Ｔｈｅ?ｒｏｌｅ?ｏｆ?ＮＬＲＰ３?ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ＩＬ－１?ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．??圖１?ＮＬＲＰ３炎癥小體／ＩＬ－】Ｐ信號通路在ＡＳ中的機制??［引自?ＣＶｒｃｗ／ａｒｔ洲?ｒｅｓｅａｒｃ／ｚ，?２０１８，?１２２（１２）：?１７２２－１７４０．］??在體動物基因編輯技術(shù)進？步驗證了?ＮＬＲＰ３炎癥小體／ＩＬ－ｉｐ信號通路ｂ?ＡＳ的關(guān)??系，沉默ＡｐｏＥ＿ｚ？小鼠的ＮＬＲＰ３基閔可減少ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－１８的分泌，降低斑塊中巨噬細??胞和脂質(zhì)含量，增加平滑肌細胞和膠原含量，提高斑塊穩(wěn)定性［３ｌｉ；沉默ＡｐｏＥ７－小鼠的??Ｃａｓｐａｓｅ－１基因可減少ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－ｌａ、ＩＬ－６和ＴＮＦ－ａ等炎癥因子的表達，顯著減少主動??脈全程和主動脈根部

對ＡＳ易損斑塊的干預(yù)效應(yīng)，探討干預(yù)效應(yīng)與巨噬細胞焦亡和ＮＬＲＰ３炎癥小體活化之??間的關(guān)系，旨在從整體動物、細胞分子和生物網(wǎng)絡(luò)三個水平闡明清心解瘀方調(diào)控巨噬細??胞焦亡、穩(wěn)定ＡＳ易損斑塊的效應(yīng)特點及抗炎和免疫調(diào)節(jié)機制（圖１）。??３５??
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本文編號：2845309