本論文研究內容屬于國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201407002)、江蘇省產學研合作前瞻性聯合研究項目(BY2015008-04)和寧夏重點研發(fā)計劃(東西部合作項目)(2017BY079)的部分研究內容。本論文分為三個章節(jié),主要結果歸納如下:第一章文獻研究查閱本草,對黃芪基源植物來源、品種及藥用部位進行考證,并對其地上部分相關藥用記載及化學成分和藥理活性研究進展進行綜述,歸納分析了現有關于黃芪花資源化利用的研究專利,探索性提出黃芪花資源開發(fā)利用價值與利用途徑,以期為黃芪資源的系統利用及產業(yè)化開發(fā)提供科學依據。第二章黃芪花及地上部分化學成分的分析與評價(一)為明確黃芪花中初生代謝產物組成及分布特征,分別采用超高效液相色譜-質譜聯用法(UPLC-TQ/MS)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、紫外可見分光光度法、高效液相色譜法和BCA試劑盒法,分別對黃芪花中的初生代謝產物包括核苷與氨基酸類、脂肪酸類、糖類(多糖、單糖和寡糖)和可溶性蛋白成分進行分析與評價。結果表明,黃芪花中共檢測到6種核苷類成分(總量為0.28%)和15種氨基酸類成分(總量為0.65%)及豐富的可溶性多糖(4.69%)、果糖(4.55%)、葡萄糖(0.87%)、蔗糖(0.11%)和可溶性蛋白質類(31.48%)成分。此外還檢出8種脂肪酸類成分,其中肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸為其主要組成成分。(二)分別采用紫外可見分光光度法、UPLC-TQ/MS和GC-MS法對黃芪花中次生代謝產物包括黃酮類、酚酸類、皂苷類和揮發(fā)性成分進行分析與評價。結果表明,黃芪花中總黃酮含量為0.52%,總酚酸含量為3.83%,總皂苷含量為1.62%。黃酮類成分中以金絲桃苷(725.7±6.6 ug·g-1)和異槲皮苷(449.6±1.7 μg·g-1)含量相對較高,而芒柄花素(0.33±0.02,ug·g-1)含量較低。黃芪花中共檢測出32種揮發(fā)性成分,以含氧衍生物為其主要組成成分。(三)采用UPLC-TQ/MS法分析了7月份不同產地蒙古黃芪和膜莢黃芪不同部位中25種黃酮類、酚酸類及皂苷類化學成分、22種游離氨基酸和核苷類化學成分的分布情況。結果表明,二氫黃酮類、異黃烷類、異黃酮類、黃酮類、紫檀烷類、酚酸類和皂苷類的含量不僅在同一物種的不同器官中,而且在不同物種的同一器官中也存在顯著差異。此外,兩種不同物種植物中相同類型的化合物的含量顯著不同。所有黃芪花樣品中以甘肅省岷縣麻子川產的蒙古黃芪花中總核苷和氨基酸類成分含量最高,且其主要成分為天冬酰胺。研究結果為黃芪花的資源利用提供了科學支撐。第三章黃芪花生物活性評價與資源價值發(fā)現(一)黃芪花抗氧化及神經保護活性研究本節(jié)通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除法和Fe3+還原能力(FRAP)法分別對經大孔樹脂分離制備的黃芪花五個化學部位進行抗氧化活性評價。結果表明,在五個洗脫部位中,ME(50%洗脫液)部位的清除DPPH自由基(IC50=35.10±0.26 μg.mL-1)、ABTS自由基(IC50=22.02±2.70μg.mL-1)和Fe3+還原能力(3.00±0.13 μmol Fe2+·g-])均最強,并接近BHT陽性對照組。采用UPLC-TOF/MS對抗氧化活性部位ME進行化學成分鑒定,共檢測到5 1個化合物,確認了31個化合物的結構(4個酚酸類、19個黃酮類、3個異黃酮類、2個紫檀烷類和3個皂苷類化合物)。采用紫外可見分光光度法、UPLC-TQ/MS法分析了各提取部位中酚酸類和黃酮類化學成分含量,結果顯示:ME部位的總酚酸含量(1.87±0.03 mgg1)和總黃酮含量均最高(36.40±1.23 mg.g-1)。其中,金絲桃苷(16.29±0.20 mg.g-1)是ME中主要成分,其次為蘆丁(6.10±0.08 mg.g-1)、異鼠李素-3-0-葡萄糖苷(4.97±0.05 mg.g-1)和紫云英苷(4.81±0.03 mg·g-1)。化學成分與抗氧化相關性分析結果表明體外抗氧化能力與總酚酸和總黃酮含量呈較強的相關性,其中咖啡酸和毛蕊異黃酮苷與抗氧化活性相關性最強。研究結果表明黃芪花5 0%乙醇洗脫部位具有較強的抗氧化能力,具有潛在資源化利用價值。此外,基于谷氨酸致HT22細胞的氧化應激損傷模型,研究了黃芪花不同化學部位及其化學單體鼠李檸檬素、紫云英苷、山柰酚、7,2'-二羥基-3',4'-二甲氧基異黃烷苷、大豆皂苷、蘆丁單體抑制谷氨酸毒性下的HT22細胞凋亡活性。結果表明,5個部位中ME部位抑制活性最強,且呈現濃度相關性;各單體化合物均不同程度抑制谷氨酸毒性下的HT22細胞凋亡,其中鼠李檸檬素活性最強,其次為山柰酚,其抑制細胞凋亡活性強于陽性對照Trolox,而蘆丁較弱�；赨PLC-QTOF/MS技術對谷氨酸干預的HT22細胞內差異代謝物進行代謝組學分析,結果顯示ME部位給藥后可能影響了亞硒酸代謝和鞘脂代謝通路。研究結果為研究L-谷氨酸致HT22細胞損傷發(fā)生的分子機制和藥物作用機制提供基礎,也為黃芪花的神經保護藥物研發(fā)提供了依據。(二)黃苗花防治肺纖維化作用研究本節(jié)基于過氧化氫致HELF細胞的氧化損傷體外模型,研究了黃芪花不同化學部位及槲皮素、咖啡酸、山柰酚、異槲皮苷、原兒茶酸和金絲桃苷單體對過氧化氫所致HELF細胞氧化損傷的保護活性。結果表明黃芪花多糖部位(DT)部位保護過氧化氫氧化損傷下的HELF細胞的作用最強,且其作用強度與濃度成依賴性相關。對于6種受試單體化學成分,在等濃度條件下咖啡酸的活性最強。通過氣管內滴注博來霉素誘導c57BL/6小鼠肺纖維化體內模型,以黃芪花多糖部位(D T)、黃芪花10%乙醇洗脫液(LE)、黃芪花50%乙醇洗脫液(ME)、黃芪花90%乙醇洗脫液(HE)部位給藥21天后,收集血清、尿液及肺組織樣本,分別進行生化指標測定、肺組織病理學分析。結果表明,黃芪多糖DT給藥后小鼠體重與肺系數均有恢復到正常組的趨勢,能顯著降低MDA和HYP、TGF-β1和TNF-α含量,改善T-AOC水平,從而發(fā)揮防治肺纖維化作用。該結論與在體外模型中的結果一致。基于UPLC-QTOF/MS技術,采用代謝組學研究方法對黃芪花DT、LE、ME、HE部位對肺纖維化小鼠的干預作用機制進行了研究,結果在小鼠血清及尿液樣本中鑒定出23種內源性代謝物(血清11種,尿液12種),分別從血清中構建影響值相對較高的7條相關代謝通路,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(1)、花生四烯酸代謝(2)、萜類骨架生物合成(3)、丙酮酸代謝(4)、酪氨酸代謝(5)、色氨酸代謝(6)和半胱氨酸和蛋氨酸代謝(7),影響值分別為0.50、0.35、0.25、0.18、0.14、0.11和0.11。從尿液中構建影響值相對較高的5條相關代謝通路,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(1)、甲烷代謝(2)、生物素代謝(3)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(4)和類固醇激素生物合成(5),影響值分別為1、0.40、0.30、0.26、0.18。黃芪各部位藥物干預后,有8種標志物有一定程度的回調(P0.05),所有樣本共涉及了6條代謝通路,分別為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,半胱氨酸和蛋氨酸代謝,丙酮酸代謝,酪氨酸代謝,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。研究結果從代謝通路方面驗證了黃芪花對博來霉素誘導的肺纖維化小鼠有較好的改善作用。基于中醫(yī)肺腸軸理論,通過16S rDNA測序的方法研究黃芪花DT、LE和ME部位對肺纖維化小鼠腸道菌群多樣性的調節(jié)作用機制。研究發(fā)現,與對照組比較,肺纖維化模型組小鼠腸道菌群從門分類水平到屬分類水平均發(fā)生了變化;其中與空白組相比,模型組c57BL/6小鼠腸道菌中Cyanobacteria(藍藻門)、Erysipelotrichaceae(韋榮球菌科)、Rumini clostridium_1(瘤胃梭菌屬)、Ruminococcus_1(瘤胃球菌屬)、Butyricimonas(丁酸弧菌屬)和Gastranaerophilales相對豐度顯著上升(P0.05),Ruminococcaceae_UCG-005(瘤胃菌屬_UCG-005)和Ruminococcaceae_UCG-004(瘤胃菌屬_UCG-004)相對豐度顯著下降(P0.05),表明肺纖維化小鼠體內發(fā)生了一定程度的腸道菌群失調。而給藥組(除g_Rumi nococcaceae_UCG-005外)可不同程度的改善以上腸道菌群在模型組中的相對豐度。說明黃芪花對肺纖維化小鼠的肺部保護作用可能通過糾正菌群紊亂,進而影響體內免疫平衡達到防治肺纖維化的作用�；谂c代謝組學相關性分析,闡明了腸道菌與潛在生物標記物之間的關系,為臨床診斷、醫(yī)學治療和病理生理學研究提供支持。
【學位單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R284.1
【部分圖文】：

黃芪不同器官中初生代謝和次生代謝成分進行分析與評價，闡明各中的分布、組成及含量，并且明確黃芪花區(qū)別于其他器官中的化學基礎上，采用體內外生物活性評價模型對黃芪花中資源化利用研究。圖１－３－１。??塞＇古黃戾（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ?ｍｅｍｈｒｕｍｉｃｅｕｓ？、批？?ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ）花??

圖２－１－２黃芪花脂肪酸類化學成分分析ＧＣ－ＭＳ總離子流圖??（Ａ．混合對照品溶液；Ｂ．黃芪花樣品溶液）??１．肉豆蔻酸；２．棕櫚酸；３．油酸；４．硬脂酸；５．亞油酸；６．亞麻酸；７．花生酸；８．山崳酸???２－１－２?Ｔｏｔａｌ?ｉｏｎ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ?ｏｆ?ｆａｔｔｙ?ａｃｉｄｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｆｌｏｗｅｒｓ?ｏｆ?Ｆａｔｔｙ?ａｃｉｄ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｓｕｂｓｔａｎｃｅ?ｂｙ?ＭＳ?（Ａ．?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ；?Ｂ．?Ｓａｍｐｌｅ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ）??Ｋ？ｒ?１?ｌ？Ｏｒ?Ｉ?２?Ｗ〇ｒ?？?３??？?ｍ?ｆｔ?ａ＞?Ｐ??ｔｉ?１：?１：??１?Ｊ．ｌ??１???２ＷＪ?２７．０?２７．２?２７＾４?２７．６?Ｚ７．８?Ｊ＆４?３Ｓ．６?．％８?３＆．０?％２?５＆４?３＆６?４１８?４＾０?４Ｓ２?４Ｓ．４?４Ｒ．６?４Ｓ．８??產ｍ??４＊ｉ４?４Ｓ６?４Ｓ．８?４６．０?４＆２?４＆４?４Ｓ４?－？．６?４＆８?４＆０?４＆２?４＆４?４＆６?４＆６?４７．１）?＾７．２?４７．４?４７．６?４７＾??油ｆ?纟?７?棚ｆ?（ｉ?８?，?ＩＳ??８０?ｊ＼?？：?Ａｓ?＊：??

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本文編號：2844613