目的:建立靈芝的特異性PCR鑒別方法;分別建立測定靈芝藥材中麥角甾醇、尿苷和腺苷、靈芝酸A的高效液相色譜方法,為完善靈芝藥材質(zhì)量控制提供參考方法,同時比較不同產(chǎn)地靈芝中三類化合物的含量差異。方法:第一,收集12批靈芝藥材,依據(jù)《中國藥典》規(guī)定,對這些藥材的性狀、水分、總灰分、浸出物、顯微鑒別等項目進行檢查。第二,建立特異性PCR鑒別方法。第三,建立高效液相色譜含量測定方法。1.靈芝藥材中麥角甾醇的含量測定方法。色譜條件:色譜柱為Welch Ultimate LP-C_(18)柱(4.6×150mm,5μm),流動相100%甲醇,流速1ml/min,柱溫26℃,DAD檢測,波長283nm,進樣量5μl;同時對方法學(xué)進行考察。2.靈芝藥材中尿苷和腺苷的含量測定方法。色譜條件:色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6×150mm,5μm);流動相甲醇(A)-0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液(B)梯度洗脫,比例A%:5%(0min)→5%(10min)→13%(15min)→13%(25min),流速0.8mL/min,柱溫26℃,DAD檢測,波長260nm,進樣量對照品3μl,供試品10μl;同時對方法學(xué)進行考察。3.靈芝藥材中靈芝酸A的含量測定方法。色譜條件:色譜柱為Welch Xtimate~(TM)-C_(18)柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相乙腈-0.01%醋酸(體積比37:63),流速為1mL/min,柱溫30℃,進樣量10μL,蒸發(fā)光散射器漂移管溫度為105℃,空氣流速2.8L/min;同時對方法學(xué)進行考察。結(jié)果:靈芝藥材的性狀、水分、總灰分、浸出物、顯微鑒別等都符合《中國藥典》的規(guī)定;建立的特異性PCR鑒別方法,凝膠成像結(jié)果條帶單一清晰;麥角甾醇的回歸方程為Y=1531.1X+3.358(r=1),進樣量在0.0832~1.664μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系,其平均加樣回收率為98.68%(RSD=1.9%);尿苷、腺苷的回歸方程分別為Y=7.5404X-10.409(r=0.9998),Y=27.845X-9.2962(r=0.9999),濃度分別在2.825~90.4μg/mL、0.985~98.5μg/mL范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系,尿苷、腺苷平均加樣回收率為97.22%(RSD=0.56%),97.71%(RSD=0.60%);靈芝酸A的回歸方程為Y=1.765X+5.5352(r=0.9998),進樣量在0.8928~5.3568μg范圍內(nèi),峰面積的對數(shù)值與進樣量的對數(shù)值具有良好的線性關(guān)系;其平均加樣回收率為95.81%(RSD=0.8%)。結(jié)論:本研究建立的特異性PCR鑒別方法能夠快速、簡單地進行操作,結(jié)果準(zhǔn)確;而三種HPLC含量測定方法,操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,可為靈芝的質(zhì)量控制提供參考方法;同時測定的不同產(chǎn)地的靈芝藥材,三類化合物的含量差別較大,質(zhì)量參差不齊,購買和使用是一定要注意其質(zhì)量問題。
【學(xué)位單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R284.1
【部分圖文】：

表 1 靈芝藥材來源信息表號 批號 產(chǎn)地 供樣單位L1 160106 云南 蚌埠市九州大藥房L2 160327 吉林 蚌埠市綠十字醫(yī)藥連鎖有限公L3 160411 山西 蚌埠市瑞康大藥房L4 20150818 山東 安徽新興中藥材飲片有限公司L5 1512079 吉林 蚌埠市中醫(yī)醫(yī)院L6 1606108 安徽 亳州千草藥業(yè)有限公司L7 160709 山西 亳州市永剛飲片廠有限公司L8 20151023 山西 蚌埠市華源大藥房L9 160522 安徽 蚌埠市大明藥房10 160128 安徽 安徽捷眾生物化學(xué)有限公司11 — 四川 成都荷花池藥材市場12 — 四川 成都荷花池藥材市場對收集的十二批靈芝藥材樣品進行觀察并拍照，具體形態(tài)見圖 1。

LEICADM750 生物顯微鏡 德國徠卡儀器有限公司齒輪牌載玻片（25.4 × 76.2mm） 上海精輪工業(yè)玻璃有限公司世泰顯微鏡蓋玻片（22 × 22mm） 江蘇世泰實驗器材有限公司飛鷹牌單面保安刀片 上海吉列有限公司水合氯醛試液 自制1.2 實驗方法依據(jù) 2015 年版《中國藥典》四部通則 2001 項下粉末制片法[21]制備。樣品粉末過五號篩，挑取少量粉末放置于載玻片上，滴加水合氯醛試液，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。1.3 實驗結(jié)果實驗結(jié)果見圖 2。

增程序：94℃ 5min，35 個循環(huán)（94℃ 30s，50℃ 30s，72℃30s），72℃電泳檢測脂糖凝膠制備：稱取 0.53g 瓊脂糖，加入 35ml 1 × TAE 電泳緩沖液為蒸發(fā)量，微波爐中火加熱至瓊脂糖全部融化，冷卻至 65℃，加入d，混勻，倒入內(nèi)槽板，避免氣泡的產(chǎn)生，室溫下靜置至凝固，輕拔樣：在封口膜上將擴增產(chǎn)物 1μl 與 5μl 的 6 × loading buffer 混合，用脂糖凝膠的孔內(nèi)。泳：加樣后，立即進行電泳，電壓不超過 5V/cm，當(dāng)溴酚藍移動到止電泳。測：取出瓊脂糖凝膠塊，置凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存結(jié)果。驗結(jié)果膠成像結(jié)果見圖 3。
【參考文獻】

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本文編號：2844604