天然產(chǎn)物芒果苷(mangiferin,M)作為一種氧雜蒽酮糖苷類化合物在降脂、降糖、減肥、抗炎和抗氧化方面表現(xiàn)出良好效果,天然產(chǎn)物小檗堿(berberine,B)作為一種異喹啉類生物堿在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面也表現(xiàn)出良好藥理活性。本研究首先運(yùn)用化學(xué)方法將M和B通過(guò)離子鍵連接形成單一的穩(wěn)定分子,制備新化合物芒果苷小檗堿(mangiferin-berberine,MB)鹽,然后對(duì)MB鹽在HepG2細(xì)胞中調(diào)控糖脂代謝的活性和機(jī)制進(jìn)行了深入研究,并與M或B單獨(dú)應(yīng)用進(jìn)行了對(duì)比。首先利用MTT法檢測(cè)了 M,B,MB鹽三個(gè)化合物的體外毒性,以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物處理濃度的選擇提供參考。接著Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)化合物對(duì)腺苷酸依賴的蛋白激酶 α(AMP-activated protein kinase α,AMPKα)第 172 位蘇氨酸(Thr172)和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoAcarboxylase,ACC)第79位絲氨酸(Ser79)磷酸化水平的影響,以試劑盒檢測(cè)化合物對(duì)肉毒堿棕櫚�；D(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1)活力的影響。在調(diào)節(jié)糖類代謝方面,通過(guò)試劑盒檢測(cè)三個(gè)化合物對(duì)基礎(chǔ)水平以及胰島素刺激的糖消耗的促進(jìn)作用;通過(guò)試劑盒檢測(cè)三個(gè)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞糖異生的抑制作用,與此對(duì)應(yīng),通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR,qPCR)檢測(cè)三個(gè)化合物對(duì)糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase,PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase)mRNA表達(dá)水平的影響。在調(diào)節(jié)脂類代謝方面,首先通過(guò)qPCR的方法檢測(cè)三個(gè)化合物對(duì)低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor,LDLR)mRNA 表達(dá)水平的影響,接著利用油酸(oleic acid,OA)造模,建立HepG2細(xì)胞脂肪變性模型,通過(guò)油紅O(ORO)染色法以及測(cè)定細(xì)胞內(nèi)三酰甘油(triglyceride,TG)含量的方法觀察三個(gè)化合物降低細(xì)胞內(nèi)脂肪的作用,與此對(duì)應(yīng)利用qPCR的方法檢測(cè)細(xì)胞脂肪合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)和碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate-responsive element-binding protein,ChREBP)及其靶基因如脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)和固醇輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD1)的 mRNA 表達(dá)水平。利用 AMPK 特異性抑制劑compound C(CC)進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在HepG2細(xì)胞內(nèi)化合物M對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的的半數(shù)抑制濃度(IC50)大于400μM,化合物B對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50為133.9±10.6μM,化合物MB鹽對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50為131.0±9.4μM。結(jié)果還表明三個(gè)化合物均能劑量依賴地促進(jìn)AMPK-α(Thr172)磷酸化、ACC(Ser79)磷酸化并增加CPT1活力,并且這些作用均能被CC預(yù)處理所完全阻斷。MB鹽刺激AMPK通路的效果顯著優(yōu)于同等摩爾濃度的M或B單獨(dú)應(yīng)用。在調(diào)節(jié)糖類代謝方面,三個(gè)化合物均能促進(jìn)基礎(chǔ)水平糖消耗和胰島素刺激的糖消耗,且MB鹽的效果明顯優(yōu)于同等摩爾濃度的M或B單獨(dú)應(yīng)用。B和MB鹽能促進(jìn)細(xì)胞乳酸釋放,而M沒(méi)有效果。MB鹽中的M部分通過(guò)AMPK依賴的方式來(lái)促進(jìn)細(xì)胞糖消耗,而其中的B部分通過(guò)AMPK非依賴的途徑來(lái)促進(jìn)糖消耗;MB鹽促進(jìn)細(xì)胞糖消耗的作用部分依賴于AMPK,而促進(jìn)細(xì)胞乳酸釋放的作用不依賴于AMPK。另外,MB鹽顯著抑制細(xì)胞糖異生,并且其作用也優(yōu)于M或B單用,且該作用依賴于AMPK。MB鹽在抑制糖異生的過(guò)程中能夠顯著下調(diào)糖異生關(guān)鍵酶PEPCK和G6Pase的mRNA表達(dá)水平。在調(diào)節(jié)脂類代謝方面,MB鹽能顯著抑制OA誘導(dǎo)的細(xì)胞脂肪變性,降低細(xì)胞內(nèi)TG含量,下調(diào)SREBP-1c,ChREBP,Fas,SCD1mRNA表達(dá)水平,其效果顯著優(yōu)于同等摩爾濃度的M或B單獨(dú)應(yīng)用,且MB鹽的這種作用依賴于AMPK的激活。MB鹽在體外調(diào)控糖脂代謝的活性與同等摩爾濃度的M加B聯(lián)合應(yīng)用(M+B)相當(dāng),但作為穩(wěn)定的單一分子,MB鹽在體內(nèi)可能更易吸收,具有更好的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。本研究表明,新化合物MB鹽通過(guò)激活A(yù)MPK/ACC/CPT1通路以及抑制脂肪合成基因的表達(dá)來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)TG的含量;通過(guò)激活A(yù)MPK下調(diào)PEPCK和G6Pase的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞糖異生;分別通過(guò)激活A(yù)MPK(M)和促進(jìn)乳酸釋放(B)來(lái)刺激糖消耗。MB鹽在HepG2細(xì)胞中調(diào)節(jié)糖脂代謝的效果顯著優(yōu)于單用M或B。該化合物結(jié)合了 M和B的優(yōu)點(diǎn),有望將來(lái)開(kāi)發(fā)用于治療糖脂代謝紊亂。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖.目吐T比時(shí)..婦(25州她)
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2843080