目的:對(duì)東方鈴蟾皮膚分泌物中的活性多肽進(jìn)行分子克隆和分離鑒定,并進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能,為此類(lèi)抗菌和抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:1.通過(guò)柱式法提取東方鈴蟾皮膚總RNA,并使用SMARTer?RACE試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建c DNA文庫(kù)。設(shè)計(jì)引物,并通過(guò)RT-PCR技術(shù)對(duì)c DNA文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物通過(guò)p GEM?-T Easy載體系統(tǒng)進(jìn)行克隆,對(duì)不同的克隆子進(jìn)行基因測(cè)序。2.利用Chromas和Vector-NTI軟件對(duì)測(cè)序基因進(jìn)行編輯處理。將得到的核苷酸和氨基酸序列信息通過(guò)BLASTn和BLASTp檢索,與EMBL-EBI、NCBI和Swiss Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性對(duì)比分析,推導(dǎo)出東方鈴蟾成熟肽前體序列。通過(guò)Align X軟件,與同源多肽前體序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)。3.通過(guò)反相高效液相色譜法,對(duì)東方鈴蟾皮膚分泌物中的多肽組分逐級(jí)分離,通過(guò)質(zhì)譜法測(cè)定多肽的分子量和一級(jí)結(jié)構(gòu)。4.采用固相合成法合成鑒定出的東方鈴蟾皮膚分泌物中的活性多肽,通過(guò)I-TASSER網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器預(yù)測(cè)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu),使用Heliquest網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器預(yù)測(cè)多肽的螺旋輪狀圖和理化性質(zhì),如疏水性、疏水力矩、凈電荷(Z)等。通過(guò)圓二色光譜法測(cè)定多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。5.通過(guò)MIC和MBC實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)多肽的抑菌活性,通過(guò)溶血活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)多肽的生物安全性和毒性。6.采用MTT比色法檢測(cè)兩種多肽對(duì)人肝癌Hep G2、SK-HEP-1和Huh7細(xì)胞,人前列腺癌PC3細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞和人黑素瘤A375細(xì)胞的增值抑制活性。結(jié)果:1.以東方鈴蟾皮膚總RNA為模版,成功構(gòu)建了東方鈴蟾皮膚c DNA文庫(kù)。根據(jù)Genebank已報(bào)導(dǎo)編碼鈴蟾類(lèi)多肽c DNA5’端非翻譯區(qū)的保守序列設(shè)計(jì)引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到一個(gè)新型bombinin多肽前體c DNA序列。2.Bombinin多肽前體c DNA序列共編碼兩種bombinin多肽,一種為首次發(fā)現(xiàn)的bombinin H型多肽,命名為Bombinin H-BO,另一種為已報(bào)導(dǎo)的bombinin類(lèi)似肽-BLP-7。3.通過(guò)高效液相法,從東方鈴蟾皮膚分泌物中分離出BLP-7和Bombinin H-BO兩種多肽,利用質(zhì)譜技術(shù)解析兩種多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)分別為:BLP-7(GIGGALLSAGKSALKGLAKGLAEHFAN-NH2),Bombinin H-BO(IIGPVLGLIGKALGGLL-NH2)。4.通過(guò)固相合成法成功合成兩種bombinin多肽,純度95%。多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,BLP-7中α-結(jié)構(gòu)域的比例為74.07%,帶有2個(gè)正電荷;Bombinin H-BO中α-結(jié)構(gòu)域的比例為64.71%,帶1個(gè)正電荷。兩種多肽都具有兩親性。5.BLP-7具有顯著抑菌活性,對(duì)大腸桿菌的MIC為6.3μM,金黃色葡萄球菌的MIC為6.3μM,白色念珠菌MIC為12.5μM。Bombinin H-BO在最大受試濃度159.7μM時(shí),對(duì)三種微生物的抑制率約為50%。BLP-7在濃度為50.2μM時(shí),無(wú)溶血活性。Bombinin H-BO在濃度為80.0μM時(shí),引起38%的紅細(xì)胞溶血,濃度為159.7μM時(shí),引起85%紅細(xì)胞發(fā)生溶血。6.BLP-7和Bombinin H-BO可抑制三種人肝癌細(xì)胞和其他幾種人體癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,具有劑量依賴(lài)性。其中,BLP-7和Bombinin H-BO對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用最為顯著,作用48 h后IC50值分別為0.244μM和0.597μM。結(jié)論:1.利用分子克隆技術(shù),結(jié)合高效液相色譜及生物質(zhì)譜的研究手段,從東方鈴蟾皮膚分泌物中分離鑒定出兩種bombinin多肽-BLP-7和Bombinin H-BO,其中Bombinin H-BO的結(jié)構(gòu)為首次報(bào)道,是一種新型的bombinin H型多肽。2.BLP-7和Bombinin H-BO在體外具有抗菌、抗腫瘤等生物學(xué)活性,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,其具體的抗菌和抗腫瘤作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類(lèi)】：R284.2;R285
【部分圖文】：

圖 1.1 東方鈴蟾活性多肽的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果A 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果多肽的前體序列 S1 和 S2 與 pGEM -T Easy 載體態(tài)細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增后，通過(guò)加熱裂解法提取質(zhì)粒NA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到含有重組載體基因的 DNA4 來(lái)自 S1 的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，A5-A8 來(lái)自 S2 的轉(zhuǎn)化bpbp1000600400200M S1 S2

東方鈴蟾活性多肽的PCR擴(kuò)增結(jié)果

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、東方鈴蟾活性多肽的分離和鑒定1.2.1.3 Bombinin 多肽的基因測(cè)序結(jié)果將質(zhì)粒 DNA 擴(kuò)增后得到的不同克隆子，隨機(jī)挑選 A1、A2、A4、A5、A6、A7、A8 進(jìn)行基因測(cè)序。A1、A4 和 A5 測(cè)序結(jié)果相同，均為編碼 BLP-7 和Bominin-BO 前體的基因序列，如圖 1.3。其他 PCR 產(chǎn)物測(cè)序得到不同的 bombinin多肽前體序列。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 韓雷;謝宇輝;趙緒然;劉鵬;趙文閣;;東方鈴蟾兩性形態(tài)特征的研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2016年23期

2 李琢;賀倩;;項(xiàng)目動(dòng)物東方鈴蟾的飼養(yǎng)繁殖[J];野生動(dòng)物學(xué)報(bào);2014年S1期

3 陸書(shū)亮;;東方鈴蟾[J];水族世界;2009年04期

4 劉鵬;賈競(jìng)波;;東方鈴蟾在黑龍江省的現(xiàn)狀與保護(hù)[J];四川動(dòng)物;2007年02期

5 姜雅風(fēng);東方鈴蟾的反捕行為[J];野生動(dòng)物;2001年03期

6 鄒壽昌;東方鈴蟾繁殖期的生態(tài)學(xué)研究[J];徐州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1989年02期

7 李宗蕓,馮照軍,鄒壽昌;東方鈴蟾早期胚胎發(fā)育的初步觀察[J];徐州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1989年02期

8 徐敬明,李永臣;東方鈴蟾耐饑時(shí)間的研究[J];煙臺(tái)師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1997年04期

9 鄭元林,陳才法,茅一飛,楊克合;東方鈴蟾與中華大蟾蜍乳酸脫氫酶同工酶凝膠電泳的比較研究[J];徐州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1990年02期

10 陸宇燕,李丕鵬;昆崳山東方鈴蟾的生物學(xué)特性及保護(hù)[J];四川動(dòng)物;1999年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 周暢;東方鈴蟾活性多肽的分離鑒定及功能研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2842889