目的:對東方鈴蟾皮膚分泌物中的活性多肽進行分子克隆和分離鑒定,并進一步研究其生物學功能,為此類抗菌和抗腫瘤藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。方法:1.通過柱式法提取東方鈴蟾皮膚總RNA,并使用SMARTer?RACE試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建c DNA文庫。設(shè)計引物,并通過RT-PCR技術(shù)對c DNA文庫進行擴增。將PCR產(chǎn)物通過p GEM?-T Easy載體系統(tǒng)進行克隆,對不同的克隆子進行基因測序。2.利用Chromas和Vector-NTI軟件對測序基因進行編輯處理。將得到的核苷酸和氨基酸序列信息通過BLASTn和BLASTp檢索,與EMBL-EBI、NCBI和Swiss Prot數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行同源性對比分析,推導出東方鈴蟾成熟肽前體序列。通過Align X軟件,與同源多肽前體序列進行結(jié)構(gòu)比對。3.通過反相高效液相色譜法,對東方鈴蟾皮膚分泌物中的多肽組分逐級分離,通過質(zhì)譜法測定多肽的分子量和一級結(jié)構(gòu)。4.采用固相合成法合成鑒定出的東方鈴蟾皮膚分泌物中的活性多肽,通過I-TASSER網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器預測多肽的二級結(jié)構(gòu),使用Heliquest網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器預測多肽的螺旋輪狀圖和理化性質(zhì),如疏水性、疏水力矩、凈電荷(Z)等。通過圓二色光譜法測定多肽的二級結(jié)構(gòu)。5.通過MIC和MBC實驗評價多肽的抑菌活性,通過溶血活性測定實驗評價多肽的生物安全性和毒性。6.采用MTT比色法檢測兩種多肽對人肝癌Hep G2、SK-HEP-1和Huh7細胞,人前列腺癌PC3細胞、人肺癌A549細胞和人黑素瘤A375細胞的增值抑制活性。結(jié)果:1.以東方鈴蟾皮膚總RNA為模版,成功構(gòu)建了東方鈴蟾皮膚c DNA文庫。根據(jù)Genebank已報導編碼鈴蟾類多肽c DNA5’端非翻譯區(qū)的保守序列設(shè)計引物,利用PCR技術(shù)擴增得到一個新型bombinin多肽前體c DNA序列。2.Bombinin多肽前體c DNA序列共編碼兩種bombinin多肽,一種為首次發(fā)現(xiàn)的bombinin H型多肽,命名為Bombinin H-BO,另一種為已報導的bombinin類似肽-BLP-7。3.通過高效液相法,從東方鈴蟾皮膚分泌物中分離出BLP-7和Bombinin H-BO兩種多肽,利用質(zhì)譜技術(shù)解析兩種多肽的一級結(jié)構(gòu)分別為:BLP-7(GIGGALLSAGKSALKGLAKGLAEHFAN-NH2),Bombinin H-BO(IIGPVLGLIGKALGGLL-NH2)。4.通過固相合成法成功合成兩種bombinin多肽,純度95%。多肽的二級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)預測結(jié)果表明,BLP-7中α-結(jié)構(gòu)域的比例為74.07%,帶有2個正電荷;Bombinin H-BO中α-結(jié)構(gòu)域的比例為64.71%,帶1個正電荷。兩種多肽都具有兩親性。5.BLP-7具有顯著抑菌活性,對大腸桿菌的MIC為6.3μM,金黃色葡萄球菌的MIC為6.3μM,白色念珠菌MIC為12.5μM。Bombinin H-BO在最大受試濃度159.7μM時,對三種微生物的抑制率約為50%。BLP-7在濃度為50.2μM時,無溶血活性。Bombinin H-BO在濃度為80.0μM時,引起38%的紅細胞溶血,濃度為159.7μM時,引起85%紅細胞發(fā)生溶血。6.BLP-7和Bombinin H-BO可抑制三種人肝癌細胞和其他幾種人體癌細胞的生長增殖,具有劑量依賴性。其中,BLP-7和Bombinin H-BO對A549細胞的抑制作用最為顯著,作用48 h后IC50值分別為0.244μM和0.597μM。結(jié)論:1.利用分子克隆技術(shù),結(jié)合高效液相色譜及生物質(zhì)譜的研究手段,從東方鈴蟾皮膚分泌物中分離鑒定出兩種bombinin多肽-BLP-7和Bombinin H-BO,其中Bombinin H-BO的結(jié)構(gòu)為首次報道,是一種新型的bombinin H型多肽。2.BLP-7和Bombinin H-BO在體外具有抗菌、抗腫瘤等生物學活性,具有潛在的應(yīng)用價值,其具體的抗菌和抗腫瘤作用機制有待進一步研究。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R284.2;R285
【部分圖文】：

圖 1.1 東方鈴蟾活性多肽的 PCR 擴增結(jié)果A 的 PCR 擴增結(jié)果多肽的前體序列 S1 和 S2 與 pGEM -T Easy 載體態(tài)細胞中復制擴增后，通過加熱裂解法提取質(zhì)粒NA 進行 PCR 擴增，得到含有重組載體基因的 DNA4 來自 S1 的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，A5-A8 來自 S2 的轉(zhuǎn)化bpbp1000600400200M S1 S2

東方鈴蟾活性多肽的PCR擴增結(jié)果

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 一、東方鈴蟾活性多肽的分離和鑒定1.2.1.3 Bombinin 多肽的基因測序結(jié)果將質(zhì)粒 DNA 擴增后得到的不同克隆子，隨機挑選 A1、A2、A4、A5、A6、A7、A8 進行基因測序。A1、A4 和 A5 測序結(jié)果相同，均為編碼 BLP-7 和Bominin-BO 前體的基因序列，如圖 1.3。其他 PCR 產(chǎn)物測序得到不同的 bombinin多肽前體序列。
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本文編號：2842889