microRNA是一種22～24nt的非編碼RNA,能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達,與疾病的發(fā)生發(fā)展及病理過程密切相關(guān)。前期實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)急性缺血后會引起缺血腦組織中microRNAs的差異性表達,其中miR-140水平顯著升高,其轉(zhuǎn)錄的激活機制尚不清晰。應(yīng)激顆粒(Stressgranule,SG)是細胞為了適應(yīng)外部環(huán)境刺激和變化而產(chǎn)生的一種保護機制,急性腦缺血會引起大鼠腦組織應(yīng)激顆粒形成,腦組織的恢復(fù)與其應(yīng)激時生成應(yīng)激顆粒的形成密切相關(guān),而應(yīng)激顆粒的形成依賴于多種RNA結(jié)合蛋白對RNA的結(jié)合從而聚集。左旋樟腦是臨床常用中藥醒腦靜的有效小分子化合物,前期研究發(fā)現(xiàn)其對MCAO模型大鼠腦損傷具有保護作用,但其對microRNA-RNA結(jié)合蛋白的調(diào)控以及應(yīng)激顆粒形成的調(diào)控機制仍然不明確。因此提出“左旋樟腦作用于miR-140-HnrnpA1調(diào)控急性缺血誘導(dǎo)的應(yīng)激顆粒形成”假說。本研究通過建立無血清刺激PC12細胞模型及MCAO動物模型,探索microRNA-HnrnpA1軸對應(yīng)激顆粒形成的作用及左旋樟腦干預(yù)的分子機制。1.miR-140-HnrnpA1軸抑制應(yīng)激顆粒形成作用機制研究構(gòu)建了無血清刺激誘導(dǎo)PC12細胞應(yīng)激顆粒形成細胞模型,對無血清誘導(dǎo)時間梯度刺激的PC12細胞以G3BP1和eIF3b雙標觀察到12h的時候生成應(yīng)激顆粒的陽性細胞數(shù)最多達到55.9%,且平均每個細胞的應(yīng)激顆粒數(shù)達到3.91個顆粒/細胞,確定了12h無血清刺激的PC12細胞作為應(yīng)激顆粒形成的理想模型。進一步檢測各組細胞miR-140表達水平,發(fā)現(xiàn)無血清刺激后miR-140水平持續(xù)增加,以O(shè)h作為參照,12h時達到7.54倍,可見隨著無血清的持續(xù)刺激miR-140轉(zhuǎn)錄活性增加,確定以12h無血清刺激PC12細胞作為本研究的細胞模型。通過刪失miR-140啟動子片段構(gòu)建熒光素酶報告基因,確定了 miR-140啟動子的核心位點位于-250bp片段內(nèi),生物信息學(xué)預(yù)測得到兩個核心位點,突變核心位點序列構(gòu)建熒光素酶報告基因,確定miR-140核心位點為位于-250bp內(nèi)的位點1。構(gòu)建位點1生物素標記的DNA探針,拉取正常組和模型組細胞核蛋白,LC-MS分析得出無血清刺激后HnrnpA1與miR-140啟動子區(qū)脫結(jié)合,并經(jīng)CHIP-qPCR反向驗證。共轉(zhuǎn)染si-HnrnpA1和-250bp片段報告基因質(zhì)粒的相對熒光值高于只轉(zhuǎn)染-250bp片段報告基因質(zhì)粒,說明無血清刺激會導(dǎo)致結(jié)合于miR-140啟動子核心位點上的HnrnpA1蛋白水平降低,從而證明結(jié)合在miR-140核心啟動位點上的HnrnpA1可以抑制miR-140的轉(zhuǎn)錄激活。應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測得miR-140靶向HnrnpA1 3'UTR區(qū),雙熒光素酶報告基因證明miR-140可以靶向抑制HnrnpA1 轉(zhuǎn)染 miR-140 mimic、inhibitor 以及 si-HnRNPA1 到 PC12 細胞,無血清刺激12h免疫熒光檢測應(yīng)激顆粒發(fā)現(xiàn)miR-140下調(diào)HnrnpA1抑制應(yīng)激顆粒形成,并且通過MCAO大鼠模型側(cè)腦室注射miR-140模擬物抑制物驗證miR-140可以檢測到miR-140抑制模型大鼠腦組織中應(yīng)激顆粒形成加深腦缺血面積。本部分工作通過12h無血清刺激PC12細胞作為研究應(yīng)激顆粒的細胞模型,體內(nèi)外驗證了 HnrnpA1影響miR-140啟動子活性,miR-140靶向抑制HnrnpA1,并對應(yīng)激顆粒的形成起到抑制作用。2.TET1介導(dǎo)miR-140啟動子去甲基化促進miR-140-HnrnpA1軸形成機制研究基因的轉(zhuǎn)錄激活跟其啟動子的去甲基化水平密切相關(guān),甲基化的5位胞嘧啶5mC可以轉(zhuǎn)錄。TET酶通過將5mC加氧去甲基化為5hmC進而脫去甲基,使原本封閉的啟動子活化。這些都提示我們,HnrnpA1很可能是通過結(jié)合在miR-140核心位點上面甲基化的位點區(qū)從而阻止TET酶與甲基化的胞嘧啶接觸。無血清刺激12h時TET1表達水平顯著上升,甲基化水平降低,細胞處于高去甲基化狀態(tài);沉默TET1后,細胞整體去甲基化水平降低。進一步對miR-140核心位點處的去甲基化水平研究,結(jié)果表明無血清刺激12h后miR-140核心啟動位點處的去甲基化水平明顯升高;對過表達HnrnpA1的PC12細胞無血清刺激誘導(dǎo)12h結(jié)果發(fā)現(xiàn)其去甲基化水平并未升高,這驗證了 HnrnpA1通過結(jié)合在miR-140核心位點處甲基化的位點處,阻止了 TET1介導(dǎo)的去甲基化。本章我們從無血清誘導(dǎo)后miR-140為何會過度表達切入,探索了 TET1影響miR-140的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。3.左旋樟腦靶向TET1抑制miR-140-HnrnpA1軸促應(yīng)激顆粒形成機制研究基于TET1對miR-140的表觀調(diào)控,我們通過Biacore技術(shù)在我們確定了與TET1高親和力的是左旋樟腦,為我們干預(yù)miR-140-HnrnpA1軸從而促進應(yīng)激顆粒形成提供了靶點。首先,本實驗結(jié)果表明左旋樟腦可以降低模型大鼠腦組織缺血面積,抗腦損傷。其次,左旋樟腦是否是靶向結(jié)合了 TET1抑制其去甲基化作用,從而降低了 miR-140啟動活性中斷miR-140-HnrnpA1軸。各組大鼠腦組織冰凍切片后免疫熒光檢測TET1,5mC及5hmC水平,研究發(fā)現(xiàn)左旋樟腦可以降低TET1蛋白水平,同時提高5mC降低5hmC的水平,即左旋樟腦靶向TET1抑制其去甲基化作用。各組大鼠腦組織提取DNA后檢測miR-140啟動子甲基化,發(fā)現(xiàn)造模后給予左旋樟腦干預(yù)的大鼠腦組織的miR-140核心啟動位點區(qū)域的去甲基化水平明顯降低,說明左旋樟腦是可以靶向TET1后降低miR-140核心啟動子的去甲基化,同時HnrnpA1在給予左旋樟腦的模型大鼠腦組織中的水平相對于沒有用左旋樟腦干預(yù)的大鼠來說顯著升高。對各組大鼠的腦組織冰凍切片行免疫熒光染色,以核的熒光值作為參照,分析應(yīng)激顆粒標志物G3BP1的相對熒光值,結(jié)果發(fā)現(xiàn),左旋樟腦可以進一步升高缺血腦組織的應(yīng)激顆粒生長,從而發(fā)揮急性應(yīng)激狀態(tài)下的保護作用,有利于降低腦組織的缺血面積,起到腦保護作用。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

２丄２無血清刺激誘導(dǎo)ｍｉＲ－１４０表達??對各時間段無血清誘導(dǎo)后ＰＣ１２細胞提ＲＮＡ檢測ｍｉＲ－１４０表達水平，結(jié)果見圖３??圖２，隨著無血清誘導(dǎo)開始，隨著時間増加，ｍｉＲ－１４０表達水平逐步升高，１２ｈ時表達??升高明顯，在２４ｈ和４８ｈ持續(xù)高表達，因此選擇１２ｈ無血清刺激模型研究ｍｉＲ－１４０高??表達對無血清刺激后細胞應(yīng)激影響是較合適的時間點。??２．２?ｍｉＲ－１４０核心啟動子確定??２．２．１雙熒光素酶報告基因確定ｍｉＲ－１４０核心啟動子??ｍｉＲ－１４０的過度表達與其轉(zhuǎn)錄激活有著非常密切的關(guān)系，基因的轉(zhuǎn)錄激活受到啟??動子及啟動子上面的反應(yīng)原件的調(diào)控作用，因此對ｍｉＲ－１４０啟動子的研究成為必然。??根據(jù)ＮＣＢＩ上公布的ｍｉＲ－１４０基因序列，以轉(zhuǎn)錄起始位點上游－２０００作為其啟動區(qū)，??通過截斷設(shè)計并將不同長度ｍｉＲ－１４０啟動子的刪失片段插入攜帶螢火蟲熒光素酶的??ｐＧＬ３報告基因質(zhì)粒，以ＰＧＬ４．７４質(zhì)粒所攜帶的海腎熒光素酶作為內(nèi)參質(zhì)粒，對上游??－２０００ｂｐ，－１５００ｂｐ，?－ｌＯＯＯｂｐ，－５００ｂｐ片段的啟動活性進行檢測，尋找并篩選出啟動活??性高的片段，構(gòu)建方法見圖５．Ａ。對熒光定量結(jié)果見圖５Ｂ，結(jié)果表明，四個截斷片段??的相對熒光值均高于對照組（Ｐ＜０．０５）

ｔｉｍｅ?ｐｏｉｎｔｓ??２丄２無血清刺激誘導(dǎo)ｍｉＲ－１４０表達??對各時間段無血清誘導(dǎo)后ＰＣ１２細胞提ＲＮＡ檢測ｍｉＲ－１４０表達水平，結(jié)果見圖３??圖２，隨著無血清誘導(dǎo)開始，隨著時間増加，ｍｉＲ－１４０表達水平逐步升高，１２ｈ時表達??升高明顯，在２４ｈ和４８ｈ持續(xù)高表達，因此選擇１２ｈ無血清刺激模型研究ｍｉＲ－１４０高??表達對無血清刺激后細胞應(yīng)激影響是較合適的時間點。??２．２?ｍｉＲ－１４０核心啟動子確定??２．２．１雙熒光素酶報告基因確定ｍｉＲ－１４０核心啟動子??ｍｉＲ－１４０的過度表達與其轉(zhuǎn)錄激活有著非常密切的關(guān)系，基因的轉(zhuǎn)錄激活受到啟??動子及啟動子上面的反應(yīng)原件的調(diào)控作用，因此對ｍｉＲ－１４０啟動子的研究成為必然。??根據(jù)ＮＣＢＩ上公布的ｍｉＲ－１４０基因序列，以轉(zhuǎn)錄起始位點上游－２０００作為其啟動區(qū)，??通過截斷設(shè)計并將不同長度ｍｉＲ－１４０啟動子的刪失片段插入攜帶螢火蟲熒光素酶的??ｐＧＬ３報告基因質(zhì)粒，以ＰＧＬ４．７４質(zhì)粒所攜帶的海腎熒光素酶作為內(nèi)參質(zhì)粒，對上游??－２０００ｂｐ，－１５００ｂｐ，?－ｌＯＯＯｂｐ，－５００ｂｐ片段的啟動活性進行檢測，尋找并篩選出啟動活??性高的片段

ｐＧＬ３報告基因質(zhì)粒，以ＰＧＬ４．７４質(zhì)粒所攜帶的海腎熒光素酶作為內(nèi)參質(zhì)粒，對上游??－２０００ｂｐ，－１５００ｂｐ，?－ｌＯＯＯｂｐ，－５００ｂｐ片段的啟動活性進行檢測，尋找并篩選出啟動活??性高的片段，構(gòu)建方法見圖５．Ａ。對熒光定量結(jié)果見圖５Ｂ，結(jié)果表明，四個截斷片段??的相對熒光值均高于對照組（Ｐ＜０．０５），即四個片段均具有啟動活性，與－２〇〇〇ｂｐ片??段、－１５００ｂｐ片段及－１０００ｂｐ片段比較，－５００ｂｐ片段相對熒光值均升高（Ｐ＜〇．〇５），即??－５００ｂｐ片段的啟動活性最高，提示核心啟動子位于－５〇〇ｂｐ內(nèi)。進一步構(gòu)建－３７５ｂｐ，??１８??
【參考文獻】

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本文編號：2842796