microRNA是一種22～24nt的非編碼RNA,能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),與疾病的發(fā)生發(fā)展及病理過(guò)程密切相關(guān)。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)急性缺血后會(huì)引起缺血腦組織中microRNAs的差異性表達(dá),其中miR-140水平顯著升高,其轉(zhuǎn)錄的激活機(jī)制尚不清晰。應(yīng)激顆粒(Stressgranule,SG)是細(xì)胞為了適應(yīng)外部環(huán)境刺激和變化而產(chǎn)生的一種保護(hù)機(jī)制,急性腦缺血會(huì)引起大鼠腦組織應(yīng)激顆粒形成,腦組織的恢復(fù)與其應(yīng)激時(shí)生成應(yīng)激顆粒的形成密切相關(guān),而應(yīng)激顆粒的形成依賴于多種RNA結(jié)合蛋白對(duì)RNA的結(jié)合從而聚集。左旋樟腦是臨床常用中藥醒腦靜的有效小分子化合物,前期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)MCAO模型大鼠腦損傷具有保護(hù)作用,但其對(duì)microRNA-RNA結(jié)合蛋白的調(diào)控以及應(yīng)激顆粒形成的調(diào)控機(jī)制仍然不明確。因此提出“左旋樟腦作用于miR-140-HnrnpA1調(diào)控急性缺血誘導(dǎo)的應(yīng)激顆粒形成”假說(shuō)。本研究通過(guò)建立無(wú)血清刺激PC12細(xì)胞模型及MCAO動(dòng)物模型,探索microRNA-HnrnpA1軸對(duì)應(yīng)激顆粒形成的作用及左旋樟腦干預(yù)的分子機(jī)制。1.miR-140-HnrnpA1軸抑制應(yīng)激顆粒形成作用機(jī)制研究構(gòu)建了無(wú)血清刺激誘導(dǎo)PC12細(xì)胞應(yīng)激顆粒形成細(xì)胞模型,對(duì)無(wú)血清誘導(dǎo)時(shí)間梯度刺激的PC12細(xì)胞以G3BP1和eIF3b雙標(biāo)觀察到12h的時(shí)候生成應(yīng)激顆粒的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多達(dá)到55.9%,且平均每個(gè)細(xì)胞的應(yīng)激顆粒數(shù)達(dá)到3.91個(gè)顆粒/細(xì)胞,確定了12h無(wú)血清刺激的PC12細(xì)胞作為應(yīng)激顆粒形成的理想模型。進(jìn)一步檢測(cè)各組細(xì)胞miR-140表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)無(wú)血清刺激后miR-140水平持續(xù)增加,以O(shè)h作為參照,12h時(shí)達(dá)到7.54倍,可見(jiàn)隨著無(wú)血清的持續(xù)刺激miR-140轉(zhuǎn)錄活性增加,確定以12h無(wú)血清刺激PC12細(xì)胞作為本研究的細(xì)胞模型。通過(guò)刪失miR-140啟動(dòng)子片段構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因,確定了 miR-140啟動(dòng)子的核心位點(diǎn)位于-250bp片段內(nèi),生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到兩個(gè)核心位點(diǎn),突變核心位點(diǎn)序列構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因,確定miR-140核心位點(diǎn)為位于-250bp內(nèi)的位點(diǎn)1。構(gòu)建位點(diǎn)1生物素標(biāo)記的DNA探針,拉取正常組和模型組細(xì)胞核蛋白,LC-MS分析得出無(wú)血清刺激后HnrnpA1與miR-140啟動(dòng)子區(qū)脫結(jié)合,并經(jīng)CHIP-qPCR反向驗(yàn)證。共轉(zhuǎn)染si-HnrnpA1和-250bp片段報(bào)告基因質(zhì)粒的相對(duì)熒光值高于只轉(zhuǎn)染-250bp片段報(bào)告基因質(zhì)粒,說(shuō)明無(wú)血清刺激會(huì)導(dǎo)致結(jié)合于miR-140啟動(dòng)子核心位點(diǎn)上的HnrnpA1蛋白水平降低,從而證明結(jié)合在miR-140核心啟動(dòng)位點(diǎn)上的HnrnpA1可以抑制miR-140的轉(zhuǎn)錄激活。應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得miR-140靶向HnrnpA1 3'UTR區(qū),雙熒光素酶報(bào)告基因證明miR-140可以靶向抑制HnrnpA1 轉(zhuǎn)染 miR-140 mimic、inhibitor 以及 si-HnRNPA1 到 PC12 細(xì)胞,無(wú)血清刺激12h免疫熒光檢測(cè)應(yīng)激顆粒發(fā)現(xiàn)miR-140下調(diào)HnrnpA1抑制應(yīng)激顆粒形成,并且通過(guò)MCAO大鼠模型側(cè)腦室注射miR-140模擬物抑制物驗(yàn)證miR-140可以檢測(cè)到miR-140抑制模型大鼠腦組織中應(yīng)激顆粒形成加深腦缺血面積。本部分工作通過(guò)12h無(wú)血清刺激PC12細(xì)胞作為研究應(yīng)激顆粒的細(xì)胞模型,體內(nèi)外驗(yàn)證了 HnrnpA1影響miR-140啟動(dòng)子活性,miR-140靶向抑制HnrnpA1,并對(duì)應(yīng)激顆粒的形成起到抑制作用。2.TET1介導(dǎo)miR-140啟動(dòng)子去甲基化促進(jìn)miR-140-HnrnpA1軸形成機(jī)制研究基因的轉(zhuǎn)錄激活跟其啟動(dòng)子的去甲基化水平密切相關(guān),甲基化的5位胞嘧啶5mC可以轉(zhuǎn)錄。TET酶通過(guò)將5mC加氧去甲基化為5hmC進(jìn)而脫去甲基,使原本封閉的啟動(dòng)子活化。這些都提示我們,HnrnpA1很可能是通過(guò)結(jié)合在miR-140核心位點(diǎn)上面甲基化的位點(diǎn)區(qū)從而阻止TET酶與甲基化的胞嘧啶接觸。無(wú)血清刺激12h時(shí)TET1表達(dá)水平顯著上升,甲基化水平降低,細(xì)胞處于高去甲基化狀態(tài);沉默TET1后,細(xì)胞整體去甲基化水平降低。進(jìn)一步對(duì)miR-140核心位點(diǎn)處的去甲基化水平研究,結(jié)果表明無(wú)血清刺激12h后miR-140核心啟動(dòng)位點(diǎn)處的去甲基化水平明顯升高;對(duì)過(guò)表達(dá)HnrnpA1的PC12細(xì)胞無(wú)血清刺激誘導(dǎo)12h結(jié)果發(fā)現(xiàn)其去甲基化水平并未升高,這驗(yàn)證了 HnrnpA1通過(guò)結(jié)合在miR-140核心位點(diǎn)處甲基化的位點(diǎn)處,阻止了 TET1介導(dǎo)的去甲基化。本章我們從無(wú)血清誘導(dǎo)后miR-140為何會(huì)過(guò)度表達(dá)切入,探索了 TET1影響miR-140的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。3.左旋樟腦靶向TET1抑制miR-140-HnrnpA1軸促應(yīng)激顆粒形成機(jī)制研究基于TET1對(duì)miR-140的表觀調(diào)控,我們通過(guò)Biacore技術(shù)在我們確定了與TET1高親和力的是左旋樟腦,為我們干預(yù)miR-140-HnrnpA1軸從而促進(jìn)應(yīng)激顆粒形成提供了靶點(diǎn)。首先,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明左旋樟腦可以降低模型大鼠腦組織缺血面積,抗腦損傷。其次,左旋樟腦是否是靶向結(jié)合了 TET1抑制其去甲基化作用,從而降低了 miR-140啟動(dòng)活性中斷miR-140-HnrnpA1軸。各組大鼠腦組織冰凍切片后免疫熒光檢測(cè)TET1,5mC及5hmC水平,研究發(fā)現(xiàn)左旋樟腦可以降低TET1蛋白水平,同時(shí)提高5mC降低5hmC的水平,即左旋樟腦靶向TET1抑制其去甲基化作用。各組大鼠腦組織提取DNA后檢測(cè)miR-140啟動(dòng)子甲基化,發(fā)現(xiàn)造模后給予左旋樟腦干預(yù)的大鼠腦組織的miR-140核心啟動(dòng)位點(diǎn)區(qū)域的去甲基化水平明顯降低,說(shuō)明左旋樟腦是可以靶向TET1后降低miR-140核心啟動(dòng)子的去甲基化,同時(shí)HnrnpA1在給予左旋樟腦的模型大鼠腦組織中的水平相對(duì)于沒(méi)有用左旋樟腦干預(yù)的大鼠來(lái)說(shuō)顯著升高。對(duì)各組大鼠的腦組織冰凍切片行免疫熒光染色,以核的熒光值作為參照,分析應(yīng)激顆粒標(biāo)志物G3BP1的相對(duì)熒光值,結(jié)果發(fā)現(xiàn),左旋樟腦可以進(jìn)一步升高缺血腦組織的應(yīng)激顆粒生長(zhǎng),從而發(fā)揮急性應(yīng)激狀態(tài)下的保護(hù)作用,有利于降低腦組織的缺血面積,起到腦保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R285.5
【部分圖文】：

２丄２無(wú)血清刺激誘導(dǎo)ｍｉＲ－１４０表達(dá)??對(duì)各時(shí)間段無(wú)血清誘導(dǎo)后ＰＣ１２細(xì)胞提ＲＮＡ檢測(cè)ｍｉＲ－１４０表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖３??圖２，隨著無(wú)血清誘導(dǎo)開(kāi)始，隨著時(shí)間増加，ｍｉＲ－１４０表達(dá)水平逐步升高，１２ｈ時(shí)表達(dá)??升高明顯，在２４ｈ和４８ｈ持續(xù)高表達(dá)，因此選擇１２ｈ無(wú)血清刺激模型研究ｍｉＲ－１４０高??表達(dá)對(duì)無(wú)血清刺激后細(xì)胞應(yīng)激影響是較合適的時(shí)間點(diǎn)。??２．２?ｍｉＲ－１４０核心啟動(dòng)子確定??２．２．１雙熒光素酶報(bào)告基因確定ｍｉＲ－１４０核心啟動(dòng)子??ｍｉＲ－１４０的過(guò)度表達(dá)與其轉(zhuǎn)錄激活有著非常密切的關(guān)系，基因的轉(zhuǎn)錄激活受到啟??動(dòng)子及啟動(dòng)子上面的反應(yīng)原件的調(diào)控作用，因此對(duì)ｍｉＲ－１４０啟動(dòng)子的研究成為必然。??根據(jù)ＮＣＢＩ上公布的ｍｉＲ－１４０基因序列，以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游－２０００作為其啟動(dòng)區(qū)，??通過(guò)截?cái)嘣O(shè)計(jì)并將不同長(zhǎng)度ｍｉＲ－１４０啟動(dòng)子的刪失片段插入攜帶螢火蟲(chóng)熒光素酶的??ｐＧＬ３報(bào)告基因質(zhì)粒，以ＰＧＬ４．７４質(zhì)粒所攜帶的海腎熒光素酶作為內(nèi)參質(zhì)粒，對(duì)上游??－２０００ｂｐ，－１５００ｂｐ，?－ｌＯＯＯｂｐ，－５００ｂｐ片段的啟動(dòng)活性進(jìn)行檢測(cè)，尋找并篩選出啟動(dòng)活??性高的片段，構(gòu)建方法見(jiàn)圖５．Ａ。對(duì)熒光定量結(jié)果見(jiàn)圖５Ｂ，結(jié)果表明，四個(gè)截?cái)嗥??的相對(duì)熒光值均高于對(duì)照組（Ｐ＜０．０５）

ｔｉｍｅ?ｐｏｉｎｔｓ??２丄２無(wú)血清刺激誘導(dǎo)ｍｉＲ－１４０表達(dá)??對(duì)各時(shí)間段無(wú)血清誘導(dǎo)后ＰＣ１２細(xì)胞提ＲＮＡ檢測(cè)ｍｉＲ－１４０表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖３??圖２，隨著無(wú)血清誘導(dǎo)開(kāi)始，隨著時(shí)間増加，ｍｉＲ－１４０表達(dá)水平逐步升高，１２ｈ時(shí)表達(dá)??升高明顯，在２４ｈ和４８ｈ持續(xù)高表達(dá)，因此選擇１２ｈ無(wú)血清刺激模型研究ｍｉＲ－１４０高??表達(dá)對(duì)無(wú)血清刺激后細(xì)胞應(yīng)激影響是較合適的時(shí)間點(diǎn)。??２．２?ｍｉＲ－１４０核心啟動(dòng)子確定??２．２．１雙熒光素酶報(bào)告基因確定ｍｉＲ－１４０核心啟動(dòng)子??ｍｉＲ－１４０的過(guò)度表達(dá)與其轉(zhuǎn)錄激活有著非常密切的關(guān)系，基因的轉(zhuǎn)錄激活受到啟??動(dòng)子及啟動(dòng)子上面的反應(yīng)原件的調(diào)控作用，因此對(duì)ｍｉＲ－１４０啟動(dòng)子的研究成為必然。??根據(jù)ＮＣＢＩ上公布的ｍｉＲ－１４０基因序列，以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游－２０００作為其啟動(dòng)區(qū)，??通過(guò)截?cái)嘣O(shè)計(jì)并將不同長(zhǎng)度ｍｉＲ－１４０啟動(dòng)子的刪失片段插入攜帶螢火蟲(chóng)熒光素酶的??ｐＧＬ３報(bào)告基因質(zhì)粒，以ＰＧＬ４．７４質(zhì)粒所攜帶的海腎熒光素酶作為內(nèi)參質(zhì)粒，對(duì)上游??－２０００ｂｐ，－１５００ｂｐ，?－ｌＯＯＯｂｐ，－５００ｂｐ片段的啟動(dòng)活性進(jìn)行檢測(cè)，尋找并篩選出啟動(dòng)活??性高的片段

ｐＧＬ３報(bào)告基因質(zhì)粒，以ＰＧＬ４．７４質(zhì)粒所攜帶的海腎熒光素酶作為內(nèi)參質(zhì)粒，對(duì)上游??－２０００ｂｐ，－１５００ｂｐ，?－ｌＯＯＯｂｐ，－５００ｂｐ片段的啟動(dòng)活性進(jìn)行檢測(cè)，尋找并篩選出啟動(dòng)活??性高的片段，構(gòu)建方法見(jiàn)圖５．Ａ。對(duì)熒光定量結(jié)果見(jiàn)圖５Ｂ，結(jié)果表明，四個(gè)截?cái)嗥??的相對(duì)熒光值均高于對(duì)照組（Ｐ＜０．０５），即四個(gè)片段均具有啟動(dòng)活性，與－２〇〇〇ｂｐ片??段、－１５００ｂｐ片段及－１０００ｂｐ片段比較，－５００ｂｐ片段相對(duì)熒光值均升高（Ｐ＜〇．〇５），即??－５００ｂｐ片段的啟動(dòng)活性最高，提示核心啟動(dòng)子位于－５〇〇ｂｐ內(nèi)。進(jìn)一步構(gòu)建－３７５ｂｐ，??１８??
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本文編號(hào)：2842796