二至丸原名女貞丹,僅由女貞子和墨旱蓮兩味中藥組成,始載于明代吳旻匯編的《扶壽精方》,具有補益肝腎、滋陰止血的作用,主要用于肝腎陰虛引起的眩暈耳鳴,鼻燥咽干,腰膝酸痛,月經(jīng)量多。古書記載其能“旬日間膂力加倍。發(fā)白返黑。健腰膝。強陰不足。能令老者。無夜起之勞。”近年來有學者提出“人之衰老,以肝腎陰虛為本,而治療大法,當以滋補肝腎之陰為先。”目前已有多篇文獻報道二至丸具有抗衰老作用,但其抗衰老的機制尚未明確,使其臨床應用受到了限制,需要在細胞層面上深入研究。本論文建立了二至丸及其提取物質(zhì)量的整體評價方法,為后續(xù)實驗提供了質(zhì)量穩(wěn)定的樣品;建立了大鼠腎(NRK)細胞衰老模型,并基于此模型考察了不同提取方法酒女貞子組方制成的二至丸的體外抗衰老作用;以中藥血清藥物化學方法定性分析二至丸血中移行成分,并定量分析主要成分特女貞苷和紅景天苷;基于細胞代謝組學技術(shù)研究二至丸含藥血清對衰老NRK細胞的保護作用,探討二至丸抗衰老的可能機制。論文研究內(nèi)容主要包括以下五個部分:一、文獻研究查閱中外文獻,對比多種細胞衰老造模方法的異同,系統(tǒng)總結(jié)歸納多種細胞衰老的檢測方法的優(yōu)缺點,選擇切實可行的檢測方法,為進一步NRK細胞衰老模型建立以及二至丸體外抗衰老研究做鋪墊。二、基于C30-HPLC與層次分析法的二至丸及其提取物質(zhì)量評價方法研究基于多指標成分定量的質(zhì)量評價方法一直是中藥復方質(zhì)量研究的重要內(nèi)容之一。復方二至丸由酒女貞子的全粉和墨旱蓮水煎液浸膏所組成,《中國藥典》2015版僅針對單一成分特女貞苷進行含量測定,尚不能說明復方中藥的內(nèi)在質(zhì)量。本研究以藥典規(guī)定的復方及其組方藥材質(zhì)控成分特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯與主要活性成分紅景天苷、女貞苷、齊墩果酸、熊果酸為測定對象,建立了具有良好精密度、準確度和重復性的C30-HPLC含量測定方法,用于4種不同制備方法的二至丸樣品與4種不同溶劑系統(tǒng)提取的二至丸提取物的多成分定量分析,并使用層次分析法(AHP)對定量結(jié)果進行綜合分析,分析結(jié)果與體外抗氧化實驗(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法,DPPH法)相符合,該方法為二至丸及其它中藥復方質(zhì)量評價方法的改進提供了參考和借鑒。三、二至丸血中移行成分定性定量研究1.基于UFLC-Q-TOF-MS技術(shù)的二至丸血中移行成分定性分析采用UFLC-Q-TOF-MS對二至丸含藥血清進行分析。本實驗采用AB SCIEX Triple TOFTM 5600高分辨質(zhì)譜,采用TOF MS-IDA-MS/MS模式采集數(shù)據(jù),借助Peak View SoftwareTM質(zhì)譜分析軟件,通過軟件內(nèi)置的XIC Manager插件對采集的數(shù)據(jù)進行靶向化合物鑒別。共鑒別出27種二至丸移行成分,其中18種來自酒女貞子,7種來自墨旱蓮,其中木犀草素、芹菜素為兩者所共有。鑒別的化合物涵蓋黃酮類、苯乙醇類、環(huán)烯醚萜類、三萜類、酚類等不同類別,為解釋二至丸藥效以及血中移行成分定量打下基礎(chǔ)。2.二至丸血中主要移行成分定量分析對二至丸血中主要移行成分紅景天苷、特女貞苷進行含量測定。采用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)技術(shù),色譜分離條件:ACQUITY UPLC(?)BEHC18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱;以乙腈(A)和0.1%甲酸水(B)為流動相梯度洗脫,流速:0.3mL·min-1,柱溫:30℃;質(zhì)譜條件:采用電噴霧(ESI)離子源,在負離子模式下對各化合物進行多反應監(jiān)測模式(MRM)檢測�？瞻籽鍣z測紅景天苷、特女貞苷均無基質(zhì)效應,紅景天苷與特女貞苷可以很好的分離,無干擾。測得二至丸組紅景天苷、特女貞苷含量為3.19、0.10 μg·mL-1,EZW-3組紅景天苷、特女貞苷含量為22.29、0.14μg·mL-1。本方法可為二至丸含藥血清提供質(zhì)量控制。四、二至丸對D-半乳糖誘導NRK細胞衰老的保護作用使用不同濃度D-半乳糖(1、5、10、20、40 g.L-1)作用不同時間(24、48、72h)誘導NRK細胞衰老,β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)染色法鑒定細胞衰老;熒光素二-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)法檢測衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活力;噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖活力;以GSH-PX、SOD活力與MDA含量檢測細胞氧化應激水平。綜合評價NRK細胞衰老模型成功與否。根據(jù)FDG結(jié)果評估不同濃度的二至丸樣品(EZW-1、EZW-2、EZW-3,10、100、500和1000 mg·L-1)對衰老NRK細胞的影響,檢測GSH-PX、SOD活力與MDA含量的變化,探討二至丸對衰老NRK細胞的保護作用。與對照組相比,模型組(20 g·L-1 D-半乳糖處理48 h)β-半乳糖苷酶染色陽性率顯著增加,β-半乳糖苷酶活力顯著增加;GSH-PX、SOD活力下降,MDA含量增加,細胞活力無明顯變化。與模型組相比,給藥組β-半乳糖苷酶活力明顯降低,陽性染色率顯著下降,GSH-PX、SOD活力升高,MDA含量明顯降低。表明二至丸能夠減輕D-半乳糖誘導的NRK細胞衰老的程度,其保護效應可能與二至丸抗氧化應激效應相關(guān),且不同的二至丸樣品抗衰老的結(jié)果具有差異性,EZW-1的抗NRK細胞衰老效果優(yōu)于 EZW-2、EZW-3。五、基于細胞代謝組學技術(shù)研究二至丸對衰老NRK細胞的保護作用1.二至丸含藥血清對衰老NRK細胞的保護作用以含藥血清濃度(5%、10%、20%),給藥時間(24、48、72 h),含藥血清種類(二至丸含藥血清、EZW-3含藥血清)為影響因素,以細胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活力為評價指標,設(shè)計正交實驗,優(yōu)選二至丸含藥血清作用的條件:20%的EZW-3含藥血清作用衰老NRK細胞48 h。對比空白血清組,含藥血清組的NRK細胞的衰老狀態(tài)得到顯著改善。2.二至丸抗NRK細胞衰老的細胞代謝組學研究采用D-半乳糖復制NRK細胞衰老模型,借助氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù),對各組細胞樣本進行測定,采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)等多種方法進行模式識別,采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗及Dunn's多重比較進行單變量統(tǒng)計分析。經(jīng)PLS-DA模式識別分析,對照組、模型組和給藥組細胞樣本能夠得到很好的區(qū)分。根據(jù)PLS-DA模型的變量投影重要性(VIP)及單變量分析的P值篩選出對分類有顯著貢獻的代謝物,通過與NIST 2014標準數(shù)據(jù)庫內(nèi)置的參考光譜進行質(zhì)譜匹配來鑒定代謝產(chǎn)物,共鑒定出33種潛在生物標志物,給藥組的衰老NRK細胞胞內(nèi)的內(nèi)源性代謝物水平有不同程度的恢復。二至丸可以使D-半乳糖誘導的衰老NRK細胞胞內(nèi)的異常代謝有所恢復,其治療作用可能與苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成、甘氨酸,絲氨酸和蘇氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、花生四烯酸代謝、甘油脂代謝、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝、肌醇磷酸酯代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))等10條通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。
【學位單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

?２００．００?２４０．００?２８０．００?＾?３２０．００?３６０．００?２００．ＵＵ?２４０．００?２８０．００?＾?３２０．０Ｕ?３６０．００??圖２－１－１紅景天苷（Ａ），特女貞苷（Ｂ），女貞苷（Ｃ），蟛蜞菊內(nèi)酯（Ｄ），齊墩果酸??（Ｅ）和熊果酸（Ｆ）的紫外光譜圖??３．３色譜柱的選擇??Ｃ１８柱對齊墩果酸和熊果酸的分離度小于１．５?（圖２－１－２?Ｃ），無法進行定量??分析。當Ｃ３〇柱取代Ｃ１８柱時，分離度可達２．８０?（圖２－１－２?Ｂ），滿足定量分析的??要求。表明了?Ｃ３Ｑ柱在分離同分異構(gòu)體時比Ｃ１Ｓ柱具有更好的分離度。多層鍵合??相的Ｃ３Ｑ柱可在硅膠表面形成更為致密的Ｃ３Ｑ烷基鏈，相比Ｃ１８柱，Ｃ３Ｑ柱更長??的烷基鏈具有更強的疏水性

圖２－１－３二至丸質(zhì)量評價層次模型??

女貞苷?３．６６０??蟛蜞菊內(nèi)酯?０．０４５??齊墩果酸?０．３２１??熊果酸?０３２４表２－１－５九點數(shù)值表??同等重要??稍重要??明顯重要??強烈重要??絕對重要??以上重要性的中間值??若ｉ與ｊ的重要性之比為，貝ｊ?ｊ與ｉ的－??
【參考文獻】

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本文編號：2842499