目的:1.研究知母-黃柏藥對在正常和糖尿病模型大鼠體內(nèi)成分;2.建立芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C、知母皂苷N、知母皂苷BII、黃柏堿、木蘭花堿7種成分的血藥濃度檢測方法,探討知母-黃柏藥對給藥后,7種成分在正常和糖尿病模型大鼠體內(nèi)藥代動力學行為差異;3.研究黃柏堿在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物及代謝途徑。方法:1.采用UHPLC-LTQ-OrbitrapXL技術,分析在知母-黃柏藥對給藥后,正常和糖尿病大鼠體內(nèi)成分,糖尿病模型采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)一個月后腹腔注射35mg·Kg-1鏈脲佐菌素(STZ)建立。色譜條件:色譜柱為 ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(150 mmX2.1 mm,3.5 μm);流動相A為含有0.1%甲酸的超純水,流動相B為乙腈;梯度洗脫,0～40min,5%～14%B;40～60 min,14%～30%B;60～80 min,30%～50%B;80～90 min,50%～95%B;90～95 min,95%B;流速 0.2 mL.min-1;柱溫 30 ℃;PDA 檢測波長范圍為 200~600 nm;前3 min進廢液。質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧ESI源;使用碰撞誘導解離(CID)模式;正離子模式電噴霧電壓為4 kV;負離子模式噴霧電壓為-3.5 kV;鞘氣(ShG)為45 arb;霧化溫度為325℃;輔助氣(AG)為5 arb;吹掃氣(SwG)0 arb;一級質(zhì)譜采用傅里葉變換質(zhì)譜(FTMS)掃描模式,分辨率為30000;二級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴掃描;分辨率為15000;碰撞能為35 eV。鑒別方法:通過比較相同實驗條件下得到的知母-黃柏藥對水煎液的色譜質(zhì)譜信息,給藥后樣品與空白樣品以及對照品的色譜質(zhì)譜信息比較,對比參考文獻等方法加以確認。2.通過UHPLC-LTQ-Orbitrap XL和島津液相色譜-API4000+型三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS),檢測芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C、知母皂苷N、知母皂苷BⅡ、黃柏堿、木蘭花堿7種成分在正常和糖尿病組大鼠體內(nèi)血藥濃度。正常和糖尿病大鼠各6只,采用單次灌胃給藥知母-黃柏藥對水提物凍干粉0.16 g·Kg-1的CMC-Na混懸液(芒果苷9.36 mg·Kg-1、新芒果苷18.592mg· Kg-1、知母皂苷BⅡ 85.84mg·Kg-1、知母皂苷N 3.68 mg·Kg-1、知母皂苷C 5.104 mg·Kg-1、黃柏堿3.856mg·Kg-1、木蘭花堿 0.885 mg·Kg-1)后,測定給藥后 0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、11和24 h正常和糖尿病大鼠各成分血藥濃度,用DAS軟件計算各成分的藥代動力學參數(shù),并用SPSS統(tǒng)計相關參數(shù),比較兩組間差異。黃柏堿、木蘭花堿的測定:采用島津液相色譜-API4000+型三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS),內(nèi)標為烏頭堿,采用甲醇沉淀蛋白法處理樣品。色譜柱為ZORBAX EclipseXDB-C18柱(2.1×150mm,5 μm);流動相A為0.1%甲酸水,流動相B為乙腈,梯度洗脫(0-1min,10%-600%B;1-6min60%B),流速 0.2mL.min-1,柱溫 30 ℃,進樣量10 μL。離子源為電噴霧ESI源,噴霧電壓IS為4000 V;霧化溫度為450℃;氣簾氣CUR為40;碰撞氣CAD為10;霧化氣GAS1為50;檢測方式為正離子多離子反應監(jiān)測(MRM),用于定量分析的離子對分別為342.3→297.2(木蘭花堿),342.3→192.1(黃柏堿)。芒果苷、新芒果苷、知母皂苷N、知母皂苷C、知母皂苷BⅡ的測定:采用UHPLC-LTQ-OrbitrapXL技術,內(nèi)標人參皂苷Rg2,采用甲醇沉淀蛋白法處理樣品。色譜柱為CORTECS(?)UPLC(?)C18(2.1×100mm,1.6μm),流動相A為0.1%甲酸水,流動相B為乙腈,梯度洗脫(0-10 min,6-30%,前2.5 min進廢液;10-18 mmin,30-40%;18-20min,40-90%),流速 0.2mL·min-1,柱溫 30℃,進樣量 10 μL,分析時間 20 min。離子源為電噴霧ESI源,碰撞誘導解離(CID)檢測模式,電噴霧電壓為3.5 KV,鞘氣(ShG)為45 arb,霧化溫度為325℃,輔助氣(AG)為5 arb,吹掃氣(SwG)0 arb,分辨率為30000,質(zhì)量掃描范圍m/z為200-1200。3.采用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL技術,在灌胃給藥黃柏堿80mg·Kg-1后,檢測大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便中所含的代謝產(chǎn)物。色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1 × 150 mm,3.5 μm);流動相A為0.1%的甲酸,流動相B為乙腈,梯度洗脫(0～40 min,5%～14%B,前 3 min 進廢液),流速 0.2 mL·min-1,柱溫 30℃。離子源為電噴霧ESI源,檢測方式為正離子碰撞誘導解離(CID)模式,電噴霧電壓為4.5 KV;鞘氣(ShG)為45arb,霧化溫度為325℃,輔助氣(AG)為5arb,吹掃氣(SwG)0 arb,碰撞能為30 eV。MS1采用傅里葉變換質(zhì)譜(FTMS),分辨率為30000,質(zhì)量掃描范圍為215-900。MS2和MS3采用數(shù)據(jù)依賴掃描(DDS),分辨率為15000。代謝產(chǎn)物的鑒別:利用UHPLC-LTQ-OrbitrapXL,比較給藥后樣品與空白樣品色譜圖,初步篩選可能的代謝產(chǎn)物峰,而根據(jù)已有的代謝生物轉(zhuǎn)化類型和黃柏堿的結(jié)構(gòu)逆向推測其可能的代謝產(chǎn)物分子量和分子結(jié)構(gòu),然后在色譜和質(zhì)譜中查看是否存在,若存在,則需要對其碎片信息進行考察,來確定其是否為黃柏堿的代謝產(chǎn)物。結(jié)果:1.通過本次研究,在知母-黃柏藥對給藥后,大鼠血漿中共鑒別了原型成分16個,其中檢測的黃酮類、皂苷類、有機酸類成分共10個,來源于知母;檢測的生物堿類成分6個,來源于黃柏;代謝產(chǎn)物11個,其中芒果苷類代謝產(chǎn)物6個,生物堿類代謝產(chǎn)物5個,正常組和糖尿病組大鼠所含成分種類無差別。2.通過液質(zhì)聯(lián)用技術,對芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷N、知母皂苷C、黃柏堿、木蘭花堿7個主要成分血藥濃度檢測方法學考察,各成分在檢測條件下,線性關系良好,R均大于0.9958,準確度為(90.48±6.58)%-(108.54±5.71)%,日內(nèi)和日間精密度(RSD)均≤10.54%,各條件下穩(wěn)定性結(jié)果均在(87.92±2.24)%-(110.52±3.24)%之間,專屬性好。分別給予正常組和糖尿病組大鼠0.16 g·Kg-1知母-黃柏藥對水煎液凍干粉,由建立的定量方法測得知母皂苷N和黃柏堿在糖尿病組大鼠的AUC0~t顯著大于正常組,而知母皂苷C和黃柏堿的Cmax在糖尿病組大鼠顯著高于正常組。3.通過高分辨質(zhì)譜和LC-MS"技術,共鑒別了黃柏堿在體內(nèi)的25個代謝產(chǎn)物。其代謝形式主要有葡萄糖醛酸化、羥基化、脫氫、脫甲基、甲基化等。其中葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物主要鑒別于膽汁、尿液、血漿樣品中,羥基化和脫甲基化的代謝產(chǎn)物主要鑒別于糞便樣品中。結(jié)論:本文利用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL高分辨多級液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),在知母-黃柏藥對給藥后,鑒別正常和糖尿病大鼠血漿所含成分種類無差異。表明正常和糖尿病病理模型對知母-黃柏藥對中藥物成分進入血液中的種類無影響。但利用液質(zhì)聯(lián)用技術,研究芒果苷、新芒果苷等7個主要成分在正常和糖尿病大鼠中的藥代動力學行為,發(fā)現(xiàn):糖尿病大鼠中新芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷N、知母皂苷C和黃柏堿5個成分AUC0~t Cmax均值均高于正常組,但無統(tǒng)計學意義;知母皂苷N的AUC0~t和知母皂苷C的Cmax均值都是糖尿病組顯著高于正常組,而黃柏堿的AUC0~t和Cmax的均值在糖尿病大鼠均顯著高于正常組,說明糖尿病病理模型對部分成分的吸收和利用有影響,這可能與其發(fā)揮降糖藥理作用相關。由于黃柏堿在兩種生理模型下藥代動力學行為的差異顯著,本文利用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL高分辨多級液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),研究知母-黃柏藥對中代表性成分黃柏堿在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便樣品中的代謝情況,共鑒別黃柏堿的代謝產(chǎn)物25個,代謝產(chǎn)物主要通過葡萄糖醛酸化、羥基化、脫氫、脫甲基、甲基化代謝轉(zhuǎn)化而來。綜上所述,本研究為知母-黃柏藥對降糖作用物質(zhì)基礎的體內(nèi)成分以及體內(nèi)成分的藥代動力學和代表成分的藥物代謝方面提供了一定的科學依據(jù)。
【學位單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R284;R285.5
【部分圖文】：

廣州中醫(yī)藥大學２０１７屆碩士學位論文??知母皂苷ＢＩＩ、知母皂苷Ｎ、知母皂苷Ｃ、黃柏堿、木蘭花堿不同采血時間點的血藥濃??度。實驗所測得的血藥濃度－時間數(shù)據(jù)采用ＤＡＳ?２．０軟件，計算相關藥代動力學參數(shù)，??并用ＳＰＳＳ?２２軟件統(tǒng)計分析。??３．３實驗結(jié)果??３．?３．?１方法學考察??３．?３．?１．?１專屬性考察??黃柏堿、木蘭花堿：在選定的測定條件下，黃柏堿、木蘭花堿、烏頭堿（內(nèi)標）??的生成的基峰離子［Ｍ＋Ｈ］＋，并將其作為母離子，在相應的掃描條件下得到對應成分的子??離子掃描圖，見圖３－１。分別取來自６個不同個體的大鼠空白血漿混合，加入兩種待??測成分和內(nèi)標對照品，在選定的檢測條件下，黃柏堿、木蘭花堿和內(nèi)標的保留時間分??別為４．?５３，?４．５５和４．?８４?ｍｉｎ。３種分析成分峰形良好，分離完全，不受血漿中內(nèi)源??性物質(zhì)的干擾�？瞻籽獫{，空白血漿加黃柏堿、木蘭花堿和烏頭堿（內(nèi)標）標準品，??以及大鼠知母－黃柏藥對給藥后血漿樣品的色譜圖見圖３－２。??脫１．５８６５??

芒果苷、新芒果苷、知母皂苷ＢＩＩ、知母皂苷Ｎ、知母皂苷Ｃ：在質(zhì)譜分辨率為??３００００的前提條件下，待測成分的質(zhì)荷比在掃描范圍，芒果苷４２１．?０５７－４２１．?０９７、??新芒果?５８３．?１１０－５８３．?１５０、知母皂苷?ＢＩＩ?９１９．?４７０－９１９．?５１０、知母皂苷?Ｎ??９８１．４６０－９８１．５００、知母皂苷?Ｃ?９０１．４５５－９０１．４９５、人參皂苷?Ｒｇ２?（內(nèi)標）??８２９．?４７０－８２９．?５２０下，各成分峰形較好，分離完全，基質(zhì)干擾少。各成分的色譜圖見??

３．３．?１．２標準曲線和定量下限??分別精密吸�。玻埃�?ＵＬ黃柏堿和木蘭花堿儲備液，置于同一個１０?ｍＬ的容量瓶中，??用３０％乙腈－０．１％甲酸水定容，配制成黃柏堿２３４０?ｎｇ＿ｍＬ＇木蘭花堿２０００?ｎｇ．ｍｌ；１的??標樣，再用３０％乙腈－０．?１％甲酸水依次配制成相應濃度的系列標樣，各取系列標樣１０??ｙＬ，加入１００?ｙＬ空白血漿中，配制終濃度為黃柏堿１１７．０、５８．５、２３．４、１１．７、５．?８５、??２．３４、１．１７?ｎｇ．ｍＬ—１?和木蘭花堿?１００、５０、２０、１０、５、２、１?ｎｇ．ｍｌ／１?的系列標準血樣；??分別精密吸�。担埃�?ｙＬ芒果苷儲備液、１００?ｕＬ新芒果苷儲備液、２５０?ｕＬ知母皂苷??ＢＩＩ儲備液、５０?ｙ?Ｌ知母皂苷Ｎ儲備液和１００?ｙ?Ｌ知母皂苷Ｃ儲備液于同一個１０?ｍＬ??容量瓶中，加入５０％甲醇溶液定容，配制成濃度分別為芒果苷５６００?ｎｇ＿ｉｎＬ＇新芒果??苷?１０００?ｎｇ＿ｎｉＬ＿１、知母皂苷?ＢＩＩ５１００ｎｇ＿ｍＬ＿１、知母皂苷?Ｎ５００ｎｇ＿ｍＬ＿Ｉ和知母皂苷?Ｃ９８０??ｎｇｍｌ；１的標樣，再用５０％甲醇溶液配制成對應濃度的系列標樣，，各取系列標樣２０?ｕ?Ｌ，??２８??
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本文編號：2842236