白頭翁為毛莨科植物白頭翁Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel的干燥根,其味苦、性寒、入大腸經(jīng),具有清熱解毒、涼血止痢的作用。三萜皂苷類是白頭翁的主要有效成分,其中以五環(huán)三萜皂苷類化合物Anemoside B4即白頭翁皂苷B4(B4)和Hederacochiside C(HSC)為主要代表。本文主要圍繞HSC抗腸道病毒71型(EV71)導(dǎo)致的手足口病和B4抗順鉑(CDDP)導(dǎo)致的急性腎損傷(AKI)的藥效作用和機(jī)制展開(kāi)研究。(1)HSC作為白頭翁皂苷活性化合物,為了探討其對(duì)來(lái)自于臨床的高致病性EV71病毒的抗病毒活性及其作用機(jī)制,本研究建立了體內(nèi)外藥效學(xué)評(píng)價(jià)模型,采用分子生物學(xué)技術(shù)探討HSC對(duì)EV71感染的人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD)中與天然免疫相關(guān)的RLR信號(hào)通路的調(diào)控作用以及細(xì)胞線粒體抗病毒的作用。具體實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。(I)采用單次腹腔注射EV71(10~6 pfu)建立小鼠手足口病模型,HSC(25mg/kg)腹腔注射,連續(xù)給藥并觀察16天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EV71導(dǎo)致小鼠癱瘓和死亡,而HSC可以改善小鼠的癱瘓情況、提高小鼠存活率。取小鼠的肌肉組織做病理切片和免疫組化,發(fā)現(xiàn)EV71組小鼠肌肉纖維斷裂、萎縮現(xiàn)象明顯、病毒感染標(biāo)志物VP-1含量顯著上升,而HSC組小鼠肌肉中VP-1含量明顯減少并改善EV71導(dǎo)致的肌肉纖維斷裂、萎縮現(xiàn)象。(II)采用MTT法檢測(cè)HSC(200μM)對(duì)EV71作用于RD細(xì)胞的存活率的影響、Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSC可以提高細(xì)胞存活率并使凋亡蛋白cleaved-PARP表達(dá)下降、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上升。通過(guò)稀釋計(jì)數(shù)法測(cè)定病毒滴度、Western Blot檢測(cè)病毒指標(biāo)蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)EV71組病毒滴度明顯上升、病毒指標(biāo)蛋白VP-1和3C-Pro的表達(dá)顯著升高,而HSC可以降低病毒滴度且使病毒指標(biāo)蛋白表達(dá)下降。通過(guò)Western Blot檢測(cè)RLR信號(hào)通路相關(guān)蛋白MAVS、IRF 3、p-IRF 3、IFN-β的表達(dá),發(fā)現(xiàn)HSC明顯升高EV71導(dǎo)致的上述蛋白的表達(dá)降低,表明HSC可能通過(guò)激活RLR信號(hào)通路起抗病毒作用。此外,Western Blot的檢測(cè)結(jié)果和免疫熒光結(jié)果同時(shí)顯示,EV71導(dǎo)致線粒體分裂蛋白p-Drp 1表達(dá)升高,而HSC使之表達(dá)減少;線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果顯示,HSC可升高EV71引起的線粒體膜電位降低,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明HSC可使細(xì)胞線粒體分裂減少、升高線粒體膜電位從而恢復(fù)線粒體動(dòng)態(tài)平衡起抗病毒作用。(2)本研究為了探討B(tài)4的腎臟保護(hù)作用,建立體內(nèi)外藥效學(xué)評(píng)價(jià)模型研究B4抗CDDP導(dǎo)致AKI的活性,采用藥理學(xué)方法探討B(tài)4對(duì)CDDP導(dǎo)致AKI的抗凋亡作用及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果如下。(I)采用單次腹腔注射CDDP(15 mg/kg)建立小鼠AKI模型,B4(50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)腹腔注射,連續(xù)給藥6天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDDP(15 mg/kg)建立起穩(wěn)定的小鼠AKI模型,小鼠血中尿素氮(BUN)和肌苷(Crea)明顯升高,B4(100 mg/kg、200 mg/kg)組小鼠血清中BUN含量比CDDP組明顯降低,B4(200 mg/kg)組小鼠血清中Crea含量比CDDP組低。取小鼠腎臟組織行HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理組織學(xué)改變,發(fā)現(xiàn)CDDP組小鼠腎臟組織的腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性、蛋白管型、腎小球萎縮等,B4(200 mg/kg)明顯減輕以上病理表現(xiàn),使腎臟損傷評(píng)分顯著降低。(II)采用MTT法檢測(cè)B4對(duì)CDDP作用于人胚腎上皮細(xì)胞(HEK-293)存活率的影響,流式細(xì)胞儀檢測(cè)B4對(duì)CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)B4可以提高HEK-293細(xì)胞的存活率,抑制CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,與Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示B4組的細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白cleaved-PARP表達(dá)水平降低一致。綜上所述,HSC表現(xiàn)出良好的抗EV71病毒的作用,其機(jī)制可能與激活RLR信號(hào)通路相關(guān),此外,還可能與HSC減少細(xì)胞分裂蛋白的表達(dá)并恢復(fù)線粒體動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。B4有良好的抗CDDP導(dǎo)致AKI的作用,其機(jī)制可能與下調(diào)凋亡蛋白cleaved-PARP有關(guān)。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

37℃20min，PBS 洗 3 次，每次 2min；滴加鏈霉素化親和素試劑，37℃20min，PBS 洗 4 次，每次 5min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡檢，每張片隨機(jī)觀察 6 個(gè)高倍視野（400×），拍照，用 Image ProPlus 6.0 軟件分析計(jì)算每張相片的積分光密度值（integrated option density,IOD）。陽(yáng)性判斷以胞漿和或胞膜著咖啡色，且著色明顯高于背景或背景不著色而細(xì)胞著色者為 VP-1 陽(yáng)性細(xì)胞。2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1 HSC 對(duì)小鼠行為學(xué)的影響病毒感染后 EV71 組小鼠多數(shù)出現(xiàn)一側(cè)或雙側(cè)后肢明顯僵直，爬行困難，生長(zhǎng)變慢或死亡；HSC 給藥組小鼠上述癥狀明顯減輕。與正常組（0 分）相比，EV71 組小鼠平均臨床評(píng)分（3.5 分）顯著升高（#p＜0.05），而 HSC 給藥組小鼠平均臨床評(píng)分為 0.5 分，與 EV71 組相比有顯著降低（*p＜0.05）。此外，陽(yáng)性對(duì)照藥利巴韋林組小鼠平均臨床評(píng)分是 4.5 分，該組小鼠健康狀況比 EV71 組小鼠差。結(jié)果如圖 2-1 所示。

圖 2-2 HSC 對(duì)小鼠存活率的影響（x_ s,n=10）（#，與正常組比較；*，與 EV71 組比較）2.3.3 HSC 對(duì)小鼠肌肉組織病理形態(tài)改變的影響肉眼觀察，正常組小鼠肌肉組織形態(tài)如常，緊致有彈性；EV71 組小鼠肌肉萎縮，質(zhì)地松弛，HSC 給藥組小鼠肌肉組織形態(tài)健康，有一定彈性。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察分析，正常組小鼠肌肉組織中肌肉纖維排列緊密有序，紋理清晰EV71 組小鼠肌肉組織呈現(xiàn)纖維斷裂，萎縮現(xiàn)象；HSC 給藥組小鼠肌肉組織有明顯改善；陽(yáng)性對(duì)照藥利巴韋林組小鼠肌肉組織纖維斷裂和萎縮現(xiàn)象明顯。圖 2-3 為在 400 倍光學(xué)顯微鏡下拍攝的肌肉組織。

C 對(duì)小鼠存活率的影響（x_ s,n=10）（#，與正常組比較；*，與 EV鼠肌肉組織病理形態(tài)改變的影響正常組小鼠肌肉組織形態(tài)如常，緊致有彈性；EV71 組小鼠組小鼠肌肉組織形態(tài)健康，有一定彈性。微鏡觀察分析，正常組小鼠肌肉組織中肌肉纖維排列緊密有組織呈現(xiàn)纖維斷裂，萎縮現(xiàn)象；HSC 給藥組小鼠肌肉組織林組小鼠肌肉組織纖維斷裂和萎縮現(xiàn)象明顯。圖 2-3 為在 織。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王海俠;鄭新勇;郜盡;;白頭翁皂苷B4體外抑制人肝癌細(xì)胞HepG2增殖并誘導(dǎo)其凋亡[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年10期

2 湯新慧;嚴(yán)麗芳;徐力致;高靜;;齊墩果酸烏蘇酸積雪草酸護(hù)肝及抗氧化作用的比較研究[J];時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥;2010年11期

3 張明發(fā);沈雅琴;;齊墩果酸和熊果酸的抗糖尿病藥理[J];上海醫(yī)藥;2010年08期

4 張文遠(yuǎn);盧磊;;白頭翁醇提物對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的研究[J];西部醫(yī)學(xué);2009年04期

5 王單;王淑英;吳銀萍;王瑞;付銀峰;岳蘇華;;白頭翁提取物對(duì)CCl_4小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J];現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐;2008年05期

6 張旭;喬繼英;張榮;魏志超;蔡娟;;鴉膽子、黃連、白頭翁和檳榔對(duì)人芽囊原蟲(chóng)體外殺蟲(chóng)作用的比較[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2007年11期

7 段慧琴;張永東;索占偉;胡格;穆祥;;白頭翁素對(duì)RIMEC分泌功能的影響[J];中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志;2007年03期

8 時(shí)維靜;路振香;李立順;;白頭翁不同提取物及復(fù)方體外抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)中醫(yī)藥科技;2006年03期

9 祝國(guó)強(qiáng);侯風(fēng)琴;崔巖;;白頭翁湯對(duì)沙門(mén)氏菌感染雞的藥效學(xué)試驗(yàn)[J];畜牧與獸醫(yī);2006年05期

10 閆艷;高興政;;白頭翁體外抗陰道毛滴蟲(chóng)透射電鏡觀察[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2006年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 王蕾;Drp1和Parkin在干細(xì)胞多能性維持和重編程過(guò)程中的作用[D];南開(kāi)大學(xué);2014年

2 開(kāi)桂青;烏蘇烷和齊墩果烷型五環(huán)三萜的超分子配位色譜分析[D];合肥工業(yè)大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2841096