背景:慢性難愈性創(chuàng)面是臨床常見的疾病和難題,治療周期長,效果不理想,嚴重影響患者的康復和生活質量。血管新生是創(chuàng)面修復的重要環(huán)節(jié),大量新生的血管可以提供足夠的營養(yǎng)基礎和分泌有效物質,有利于肉芽增生,加速創(chuàng)面修復。中醫(yī)藥治療瘡瘍歷史悠久,療效獨到,其“生血”、“生肌”理論符合現代醫(yī)學之血管新生的概念和內涵。中藥黃蜀葵花被稱為“瘡家要藥”,臨床上對癰、疽、療瘡所致的潰瘍療效肯定。黃蜀葵花總黃酮是黃蜀葵花的主要有效成分,具有與黃蜀葵花相似的藥理作用。我們前期研究發(fā)現黃蜀葵花總黃酮能促進血管生成。因此推測,黃蜀葵花總黃酮可能是基于促血管生成作用而促進創(chuàng)面愈合,但其具體內在機制和作用靶點尚不清楚。目的:觀察黃蜀葵花總黃酮對慢性難愈性創(chuàng)面修復作用,并從促血管生成角度探討其內在機制和作用靶點,為臨床運用黃蜀葵花總黃酮提供實驗依據。方法:實驗一:從整體層面觀察黃蜀葵花總黃酮對慢性難愈性創(chuàng)面的療效,并分析其可能機制。首先采用激素誘導的方法建立慢性難愈性潰瘍大鼠模型,在建模成功后隨機分為5組進行處理:陰性對照組(生理鹽水)、陽性對照組(rb-bFGF)、低劑量TFA組(50mg/ml TFA)、中劑量TFA組(l00mg/mlTFA)和高劑量TFA組(200mg/mlTFA)。在干預后的第3、7、14、21d,觀測各組大鼠創(chuàng)面面積和創(chuàng)面愈合率,并進行組織病理學觀察,同時利用免疫組織化學法、免疫熒光檢測法、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)和實時熒光定量(Real-TimePCR)等分子生物學方法檢測各組大鼠創(chuàng)面組織中與血管生成相關的細胞因子如 VEGF、VEGFR2、AngⅠ、AngⅡ和 eNOS 等表達水平。實驗二:在離體層面觀察黃蜀葵花總黃酮的促血管生成作用并分析其內在機制。通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(HUVECs),分為4組:正常對照組(完全培養(yǎng)液)、抑制劑組(10μmol/LLY294002 預處理)、TFA 干預組(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL 的 TFA 分別為低、中、高劑量)、抑制劑+TFA干預組(10μmol/LLY294002預處理后,加5μg/mL、100μg/mL、20μg/mL的TFA分別為低、中、高劑量)。運用CCK8化學檢測法、劃痕實驗、Transwell實驗和管腔形成等方法觀察黃蜀葵花總黃酮對血管新生的關鍵環(huán)節(jié)如細胞增殖、遷移和管腔形成的影響,同時采用RT-q-PCR和Western Blot檢測VEGF-A/VEGFR 2-PI3K/Akt信號軸中各通路因子的變化。實驗三:再次從活體層面觀察黃蜀葵花總黃酮的促血管生成作用及與PI3K/Akt信號通路的關系。首先制備雞胚絨毛尿囊膜模型(CAM),隨機分為4組:正常對照組、抑制劑組(10μmol/LLY294002 預處理 1h)、TFA 干預組(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL 的 TFA 分別為低、中、高劑量)、抑制劑+TFA干預組(10μmol/LLY294002預處理1h后,加5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的TFA分別為低、中、高劑量)。在干預后第7d,觀察記錄雞胚存活率及存活天數;觀察雞胚絨毛尿囊膜的血管數量。結果:1.本實驗通過在大鼠創(chuàng)面局部多處肌內注射氫化可的松成功建立慢性難愈性潰瘍大鼠模型;成功建立雞胚絨毛尿囊膜模型。2.黃蜀葵花總黃酮可減少慢性難愈性潰瘍模型大鼠的創(chuàng)面面積,提高創(chuàng)面愈合率,具有促進創(chuàng)面修復的作用。3.黃蜀葵花總黃酮可以促進慢性難愈性創(chuàng)面肉芽組織增生,成纖維細胞增殖和膠原纖維沉積,增加毛細血管密度和成熟。4.黃蜀葵花總黃酮可以增加慢性難愈性大鼠創(chuàng)面與血管生成相關的細胞因子如VEGF、VEGFR2、AngⅠ、AngⅡ和eNOS等表達,提示黃蜀葵花總黃酮促進慢性難愈性創(chuàng)面的愈合很可能是通過促血管生成和調控血管生成的相關信號通路。5.黃蜀葵花總黃酮能促進體外培養(yǎng)的HUVECs增殖、遷移和管腔形成能力,上調VEGF-A、VEGFR2的表達水平和PI3K、Akt的磷酸化水平,從而促進血管生成。6.PI3K/Akt抑制劑LY294002能抑制黃蜀葵花總黃酮誘導的HUVECs增殖、遷移和管腔形成,降低黃蜀葵花總黃酮誘導上調的VEGF-A/VEGFR2-PI3K/Akt信號通路因子的表達。7.黃蜀葵花總黃酮可以增加雞胚絨毛尿囊膜模型血管數量,促進雞胚絨毛尿囊膜血管生成。8.PI3K/Akt抑制劑LY294002在活體層面同樣能抑制黃蜀葵花總黃酮誘導的雞胚絨毛尿囊膜血管生成。結論:黃蜀葵花總黃酮能促進慢性難愈性創(chuàng)面愈合,該藥理學效應與黃蜀葵花總黃酮的促血管生成作用有關,其內在機制和作用靶點是通過激活VEGF-A/VEGFR2-PI3K/Akt信號軸。本研究為黃蜀葵花總黃酮作為一種血管生成促進劑,應用于血管相關性疾病如創(chuàng)傷愈合和缺血性損傷等提供了實驗依據,同時為黃蜀葵花總黃酮的中藥現代化提供理論支撐。
【學位單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

３．?２大鼠的創(chuàng)面情況觀察??３．?２．?１各組大鼠的創(chuàng)面愈合情況比較??大鼠創(chuàng)面愈合情況如圖２－１和表２－５所示。??Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ＴＦＡ?ＴＦＡ?ＴＦＡ??（ＮＳ）?（ｒｂ－ｂＦＧＦ）?５０ｋｇ／ｋｇ?ｌＯＯｋｇ／ｋｇ?２００ｋｇ／ｋｇ??名ｍｉ］??Ｄ?１４ｐ??ａｙ＿??圖２－１各組大鼠創(chuàng)面愈合的形態(tài)學觀察??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒａｔｓ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｇｒｏｕｐｓ??２５??

３．?２．?２各組大鼠的創(chuàng)面面積比較??根據ＣＡＤ軟件測得各階段ＳＤ大鼠創(chuàng)面愈合面積，用軟件勾出需要計算的面積查詢相??關參數，得到該區(qū)域的面積，結果如表２－６和圖２－２所示。結果顯示：造模后第３ｄ，各組??創(chuàng)面愈合無顯著性差別（Ｐ＞０．０５）；造模后第７、１４、２１ｄ，陽性對照組和低中高劑量ＴＦＡ??組

血管數量和分布情況。Ｍａｓｓｏｎ染色也是利用不同的染液使胞核、膠原纖維和肌纖維呈現??不同的顏色，用以觀察和區(qū)分組織中膠原纖維、肌纖維以及炎性因子。ＨＥ染色和Ｍａｓｓｏｎ染??色病理結果如表２－８和圖２－３、圖２－４所示。??表２－８各組大鼠創(chuàng)面病理切片觀察??Ｔａｂｌｅ?２－８?Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｓｅｃｔｉｏｎｓ?ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｇｒｏｕｐｓ?ｏｆ?ｒａｔｓ??Ｇｒｏｕｐ?Ｄａｙ?３?Ｄａｙ?７?Ｄａｙ?１４?Ｄａｙ?２１??ＮＧ?間質水腫，大量間質仍有水腫和炎細胞數量較前見少量炎細胞、異??炎細胞浸潤以中炎細胞浸潤，炎細減少，成纖維細胞物及異物巨細胞，??性粒細胞為主，胞數量較前減少。已產生多量膠原成纖維細胞已產??可見成纖維細成纖維細胞已產纖維，在局部沉生多量膠原纖維，??胞、毛細血管和生膠原纖維，在局積，可見新生上皮在局部沉積，上皮??少量膠原沉積，部沉積，無上皮再?分化一般??邊緣無上皮再生生??ＰＧ?間質水腫，中等間質局部水腫，炎間質無水腫，炎細無炎性細胞分布，??量炎細胞浸潤
【參考文獻】

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本文編號：2840656