背景:慢性難愈性創(chuàng)面是臨床常見的疾病和難題,治療周期長,效果不理想,嚴(yán)重影響患者的康復(fù)和生活質(zhì)量。血管新生是創(chuàng)面修復(fù)的重要環(huán)節(jié),大量新生的血管可以提供足夠的營養(yǎng)基礎(chǔ)和分泌有效物質(zhì),有利于肉芽增生,加速創(chuàng)面修復(fù)。中醫(yī)藥治療瘡瘍歷史悠久,療效獨(dú)到,其“生血”、“生肌”理論符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之血管新生的概念和內(nèi)涵。中藥黃蜀葵花被稱為“瘡家要藥”,臨床上對(duì)癰、疽、療瘡所致的潰瘍療效肯定。黃蜀葵花總黃酮是黃蜀葵花的主要有效成分,具有與黃蜀葵花相似的藥理作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)黃蜀葵花總黃酮能促進(jìn)血管生成。因此推測(cè),黃蜀葵花總黃酮可能是基于促血管生成作用而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,但其具體內(nèi)在機(jī)制和作用靶點(diǎn)尚不清楚。目的:觀察黃蜀葵花總黃酮對(duì)慢性難愈性創(chuàng)面修復(fù)作用,并從促血管生成角度探討其內(nèi)在機(jī)制和作用靶點(diǎn),為臨床運(yùn)用黃蜀葵花總黃酮提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:實(shí)驗(yàn)一:從整體層面觀察黃蜀葵花總黃酮對(duì)慢性難愈性創(chuàng)面的療效,并分析其可能機(jī)制。首先采用激素誘導(dǎo)的方法建立慢性難愈性潰瘍大鼠模型,在建模成功后隨機(jī)分為5組進(jìn)行處理:陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽性對(duì)照組(rb-bFGF)、低劑量TFA組(50mg/ml TFA)、中劑量TFA組(l00mg/mlTFA)和高劑量TFA組(200mg/mlTFA)。在干預(yù)后的第3、7、14、21d,觀測(cè)各組大鼠創(chuàng)面面積和創(chuàng)面愈合率,并進(jìn)行組織病理學(xué)觀察,同時(shí)利用免疫組織化學(xué)法、免疫熒光檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和實(shí)時(shí)熒光定量(Real-TimePCR)等分子生物學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠創(chuàng)面組織中與血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子如 VEGF、VEGFR2、AngⅠ、AngⅡ和 eNOS 等表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)二:在離體層面觀察黃蜀葵花總黃酮的促血管生成作用并分析其內(nèi)在機(jī)制。通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),分為4組:正常對(duì)照組(完全培養(yǎng)液)、抑制劑組(10μmol/LLY294002 預(yù)處理)、TFA 干預(yù)組(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL 的 TFA 分別為低、中、高劑量)、抑制劑+TFA干預(yù)組(10μmol/LLY294002預(yù)處理后,加5μg/mL、100μg/mL、20μg/mL的TFA分別為低、中、高劑量)。運(yùn)用CCK8化學(xué)檢測(cè)法、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和管腔形成等方法觀察黃蜀葵花總黃酮對(duì)血管新生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)如細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成的影響,同時(shí)采用RT-q-PCR和Western Blot檢測(cè)VEGF-A/VEGFR 2-PI3K/Akt信號(hào)軸中各通路因子的變化。實(shí)驗(yàn)三:再次從活體層面觀察黃蜀葵花總黃酮的促血管生成作用及與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系。首先制備雞胚絨毛尿囊膜模型(CAM),隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、抑制劑組(10μmol/LLY294002 預(yù)處理 1h)、TFA 干預(yù)組(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL 的 TFA 分別為低、中、高劑量)、抑制劑+TFA干預(yù)組(10μmol/LLY294002預(yù)處理1h后,加5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的TFA分別為低、中、高劑量)。在干預(yù)后第7d,觀察記錄雞胚存活率及存活天數(shù);觀察雞胚絨毛尿囊膜的血管數(shù)量。結(jié)果:1.本實(shí)驗(yàn)通過在大鼠創(chuàng)面局部多處肌內(nèi)注射氫化可的松成功建立慢性難愈性潰瘍大鼠模型;成功建立雞胚絨毛尿囊膜模型。2.黃蜀葵花總黃酮可減少慢性難愈性潰瘍模型大鼠的創(chuàng)面面積,提高創(chuàng)面愈合率,具有促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的作用。3.黃蜀葵花總黃酮可以促進(jìn)慢性難愈性創(chuàng)面肉芽組織增生,成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維沉積,增加毛細(xì)血管密度和成熟。4.黃蜀葵花總黃酮可以增加慢性難愈性大鼠創(chuàng)面與血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子如VEGF、VEGFR2、AngⅠ、AngⅡ和eNOS等表達(dá),提示黃蜀葵花總黃酮促進(jìn)慢性難愈性創(chuàng)面的愈合很可能是通過促血管生成和調(diào)控血管生成的相關(guān)信號(hào)通路。5.黃蜀葵花總黃酮能促進(jìn)體外培養(yǎng)的HUVECs增殖、遷移和管腔形成能力,上調(diào)VEGF-A、VEGFR2的表達(dá)水平和PI3K、Akt的磷酸化水平,從而促進(jìn)血管生成。6.PI3K/Akt抑制劑LY294002能抑制黃蜀葵花總黃酮誘導(dǎo)的HUVECs增殖、遷移和管腔形成,降低黃蜀葵花總黃酮誘導(dǎo)上調(diào)的VEGF-A/VEGFR2-PI3K/Akt信號(hào)通路因子的表達(dá)。7.黃蜀葵花總黃酮可以增加雞胚絨毛尿囊膜模型血管數(shù)量,促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜血管生成。8.PI3K/Akt抑制劑LY294002在活體層面同樣能抑制黃蜀葵花總黃酮誘導(dǎo)的雞胚絨毛尿囊膜血管生成。結(jié)論:黃蜀葵花總黃酮能促進(jìn)慢性難愈性創(chuàng)面愈合,該藥理學(xué)效應(yīng)與黃蜀葵花總黃酮的促血管生成作用有關(guān),其內(nèi)在機(jī)制和作用靶點(diǎn)是通過激活VEGF-A/VEGFR2-PI3K/Akt信號(hào)軸。本研究為黃蜀葵花總黃酮作為一種血管生成促進(jìn)劑,應(yīng)用于血管相關(guān)性疾病如創(chuàng)傷愈合和缺血性損傷等提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)為黃蜀葵花總黃酮的中藥現(xiàn)代化提供理論支撐。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

３．?２大鼠的創(chuàng)面情況觀察??３．?２．?１各組大鼠的創(chuàng)面愈合情況比較??大鼠創(chuàng)面愈合情況如圖２－１和表２－５所示。??Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ＴＦＡ?ＴＦＡ?ＴＦＡ??（ＮＳ）?（ｒｂ－ｂＦＧＦ）?５０ｋｇ／ｋｇ?ｌＯＯｋｇ／ｋｇ?２００ｋｇ／ｋｇ??名ｍｉ］??Ｄ?１４ｐ??ａｙ＿??圖２－１各組大鼠創(chuàng)面愈合的形態(tài)學(xué)觀察??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒａｔｓ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｇｒｏｕｐｓ??２５??

３．?２．?２各組大鼠的創(chuàng)面面積比較??根據(jù)ＣＡＤ軟件測(cè)得各階段ＳＤ大鼠創(chuàng)面愈合面積，用軟件勾出需要計(jì)算的面積查詢相??關(guān)參數(shù)，得到該區(qū)域的面積，結(jié)果如表２－６和圖２－２所示。結(jié)果顯示：造模后第３ｄ，各組??創(chuàng)面愈合無顯著性差別（Ｐ＞０．０５）；造模后第７、１４、２１ｄ，陽性對(duì)照組和低中高劑量ＴＦＡ??組

血管數(shù)量和分布情況。Ｍａｓｓｏｎ染色也是利用不同的染液使胞核、膠原纖維和肌纖維呈現(xiàn)??不同的顏色，用以觀察和區(qū)分組織中膠原纖維、肌纖維以及炎性因子。ＨＥ染色和Ｍａｓｓｏｎ染??色病理結(jié)果如表２－８和圖２－３、圖２－４所示。??表２－８各組大鼠創(chuàng)面病理切片觀察??Ｔａｂｌｅ?２－８?Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｓｅｃｔｉｏｎｓ?ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｇｒｏｕｐｓ?ｏｆ?ｒａｔｓ??Ｇｒｏｕｐ?Ｄａｙ?３?Ｄａｙ?７?Ｄａｙ?１４?Ｄａｙ?２１??ＮＧ?間質(zhì)水腫，大量間質(zhì)仍有水腫和炎細(xì)胞數(shù)量較前見少量炎細(xì)胞、異??炎細(xì)胞浸潤以中炎細(xì)胞浸潤，炎細(xì)減少，成纖維細(xì)胞物及異物巨細(xì)胞，??性粒細(xì)胞為主，胞數(shù)量較前減少。已產(chǎn)生多量膠原成纖維細(xì)胞已產(chǎn)??可見成纖維細(xì)成纖維細(xì)胞已產(chǎn)纖維，在局部沉生多量膠原纖維，??胞、毛細(xì)血管和生膠原纖維，在局積，可見新生上皮在局部沉積，上皮??少量膠原沉積，部沉積，無上皮再?分化一般??邊緣無上皮再生生??ＰＧ?間質(zhì)水腫，中等間質(zhì)局部水腫，炎間質(zhì)無水腫，炎細(xì)無炎性細(xì)胞分布，??量炎細(xì)胞浸潤
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2840656