結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,每年世界范圍內(nèi)死于結腸癌的患者約60萬。腫瘤干細胞被認為是腫瘤發(fā)生、轉移和復發(fā)的根源,目前尚缺乏對結腸癌HT-29細胞干細胞體內(nèi)外殺傷作用及機理的系統(tǒng)性研究。中藥基于中醫(yī)理論治療,在臨床上應用已久�；诖�,本論文通過體內(nèi)外實驗,系統(tǒng)地研究了結腸癌HT-29細胞干細胞作為特異性抗原負載DC-CIK細胞和中藥槐耳顆粒及山藥提取物聯(lián)合DC-CIK細胞體系對結腸癌干細胞殺傷作用及機理。首先,利用磁珠分選方法分選HT29細胞系中CD133~+細胞,進行克隆形成與裸鼠致瘤實驗。結果表明,同一接種密度下,CD133~+細胞克隆形成率顯著高于CD133~-細胞,CD133~+細胞可致裸鼠成瘤。這些研究驗證了CD133分子作為源自HT29細胞結腸癌腫瘤干細胞特異性標志物的可行性。在上述CD133~+細胞作為結腸癌腫瘤干細胞的基礎上,制備了3種特異性抗原:(1)構建含有CD133抗原表位AC133編碼序列的原核表達質(zhì)粒,獲得純化的AC133重組蛋白,證實能夠使小鼠產(chǎn)生免疫應答,繼而構建了AC133慢病毒真核表達載體;(2)結腸癌干細胞總RNA提取物;(3)結腸癌干細胞全細胞裂解物。用上述3種結腸癌干細胞抗原分別負載DC-CIK細胞,體外殺傷HT29細胞及其干細胞,結果顯示3種體系細胞殺傷效果均強于無負載的DC-CIK細胞和單獨的CIK細胞。此外,研究了中藥槐耳顆粒及山藥提取物對HT29細胞及其干細胞的殺傷作用。結果顯示,槐耳顆粒和山藥提取物均可抑制結腸癌HT-29細胞增殖速率,使干細胞(CD133~+細胞)比例明顯降低。中藥槐耳顆粒及山藥提取物聯(lián)合DC-CIK細胞對HT29細胞及其干細胞的殺傷作用強于單獨使用槐耳顆粒及山藥提取物。隨后,建立了結腸癌干細胞荷瘤裸鼠模型,進行體內(nèi)藥效實驗及機理研究。結果表明,上述3種抗原負載DC-CIK細胞體系、中藥槐耳顆�；蛏剿幪崛∥锫�(lián)合DC-CIK細胞體系,及5-Fu聯(lián)合DC-CIK細胞體系對荷瘤小鼠的抑瘤效果強于單獨使用5-Fu、中藥槐耳顆�；蛏剿幪崛∥�、無負載的DC-CIK細胞;其發(fā)揮作用的機制主要包括CD4~+T、CD4~+T/CD8~+T和Th1型細胞因子升高,PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和Notch通路中的關鍵基因PI3KR1、Wnt1和Notch1的mRNA表達下調(diào),及Bcl-2蛋白表達下調(diào)和Bax蛋白表達上調(diào),誘導細胞凋亡�？傊�,本文通過體內(nèi)外試驗聯(lián)合證明CD133可以作為源自HT29細胞的結腸癌腫瘤干細胞特異性標志物,其相應抗原負載的DC-CIK細胞體系,以及中藥槐耳顆�；蛏剿幪崛∥锫�(lián)合DC-CIK細胞體系均對結腸癌干細胞具有較好殺傷效果,為其臨床應用研究奠定了基礎。
【學位單位】：天津大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第1章 文獻綜述
    1.1 .結腸癌的發(fā)病及其防治
        1.1.1 .結腸癌的發(fā)病趨勢
        1.1.2 .結腸癌的治療現(xiàn)狀
    1.2 .腫瘤干細胞的概念、特征及分選
        1.2.1 .腫瘤干細胞的概念
        1.2.2 .腫瘤干細胞的特征
        1.2.3 .腫瘤干細胞的分離與鑒定
    1.3 .靶向腫瘤干細胞的治療策略
        1.3.1 .單克隆抗體的治療
        1.3.2 .靶向腫瘤干細胞信號傳導通路、耐藥和凋亡的治療
        1.3.3 .免疫細胞的治療
    1.4 .中藥在惡性腫瘤治療中的作用
    1.5 .本論文研究目的及意義
第2章 結腸癌HT29細胞干細胞特異性生物標志CD133的鑒定
    2.1 .引言
    2.2 .實驗材料與方法
        2.2.1 .實驗材料
        2.2.2 .主要實驗儀器
        2.2.3 .結腸癌HT29細胞的復蘇培養(yǎng)
        2.2.4 .結腸癌CD133~-細胞和CD133~+細胞的分選
        2.2.5 .流式細胞儀檢測HT29細胞中干細胞(CD133~+細胞)的比例
        2.2.6 .克隆形成實驗檢測結腸癌細胞的克隆形成率
        2.2.7.結腸癌細胞裸鼠成瘤實驗
        2.2.8 .結腸癌移植瘤組織HE染色
        2.2.9 .RT-PCR檢測裸鼠移植瘤中CD133表達
        2.2.10 .統(tǒng)計學分析
    2.3 .結果
        2.3.1 .結腸癌HT29細胞克隆形成實驗結果
        2.3.2 .結腸癌細胞裸鼠致瘤實驗結果
        2.3.3 .結腸癌裸鼠移植瘤HE染色結果
        2.3.4 .RT-PCR檢測裸鼠移植瘤CD133表達結果
    2.4 .討論
        2.4.1 .腫瘤干細胞的發(fā)現(xiàn)
        2.4.2 .腫瘤干細胞的分離與鑒定
    2.5 .本章小結
第3章 負載CD133特異性抗原的DC-CIK細胞對結腸癌干細胞體外殺傷的研究
    3.1 .引言
    3.2 .實驗材料與方法
        3.2.1 .實驗材料
        3.2.2 .主要實驗儀器
        3.2.3 .CD133特異性抗原的制備
        3.2.4 .DC的制備與細胞免疫表型的檢測
        3.2.5 .CIK細胞的制備與細胞免疫表型的檢測
        3.2.6 .負載CD133特異性抗原的DC-CIK細胞對HT29細胞及CD133~+細胞的體外殺傷實驗
        3.2.7 .統(tǒng)計學分析
    3.3 .結果
        3.3.1 .腫瘤干細胞總RNA和全細胞裂解物的制備與鑒定
        3.3.2 .AC133原核表達載體的構建與鑒定
        3.3.3 .AC133重組慢病毒感染結果
        3.3.4 .CIK和DC細胞的形態(tài)
        3.3.5 .DC細胞和CIK細胞免疫表型分析
        3.3.6 .負載CD133特異性抗原的DC-CIK細胞對HT29細胞的體外殺傷作用
        3.3.7 .負載CD133特異性抗原的DC-CIK細胞對結腸癌HT29細胞干細胞的體外殺傷作用
        3.3.8 .負載CD133特異性抗原的DC-CIK細胞對結腸癌HT29細胞及其干細胞殺傷活性的比較
    3.4 .討論
        3.4.1 .腫瘤干細胞特異性抗原的制備
        3.4.2 .AC133重組慢病毒表達體系的構建
        3.4.3 .腫瘤免疫細胞治療
    3.5 .本章小結
第4章 槐耳顆粒及山藥提取物聯(lián)合DC-CIK細胞對結腸癌HT29細胞中腫瘤干細胞比例的影響
    4.1 .引言
    4.2 .實驗材料與方法
        4.2.1 .實驗材料
        4.2.2 .主要實驗儀器
        4.2.3.細胞毒性實驗
        4.2.4 .流式細胞儀檢測結腸癌HT29細胞干細胞比例
        4.2.5 .DC-CIK細胞對槐耳顆粒與山藥提取物作用HT29細胞前后殺傷作用的檢測
        4.2.6 .統(tǒng)計學分析
    4.3 .結果
        4.3.1 .槐耳顆粒和山藥提取物對結腸癌HT-29細胞形態(tài)的影響
        4.3.2 .槐耳顆粒和山藥提取物對結腸癌HT-29細胞增殖抑制的影響
        4.3.3 .槐耳顆粒和山藥提取物對結腸癌HT-29細胞干細胞(CD133~+細胞)表達的影響
        4.3.4 .DC-CIK細胞對槐耳顆粒和山藥提取物作用HT-29細胞前后殺傷作用的比較
        4.3.5 .DC-CIK細胞對槐耳顆粒和山藥提取物作用HT-29細胞前后CD133~+細胞比例變化的比較
    4.4 .討論
        4.4.1 .槐耳顆粒在惡性腫瘤中的治療
        4.4.2 .山藥在惡性腫瘤中的治療
    4.5 .本章小結
第5章 負載CD133特異性抗原的DC-CIK細胞、中藥及化療藥聯(lián)合DC-CIK細胞的體內(nèi)藥效研究
    5.1 .引言
    5.2 .實驗材料與方法
        5.2.1 .實驗材料
        5.2.2 .主要實驗儀器
        5.2.3 .建立結腸癌干細胞(CD133~+細胞)裸鼠模型
        5.2.4 .結腸癌干細胞荷瘤裸鼠的免疫治療
        5.2.5 .流式細胞術檢測血清T淋巴細胞亞群
        5.2.6 .ELISA法檢測血清細胞因子的含量
        5.2.7 .結腸癌移植瘤組織HE染色
        5.2.8 .免疫組化檢測移植瘤組織中Bcl-2與Bax的蛋白表達
        5.2.9 .用 RT-PCR檢測相關信號通路關鍵基因表達水平的變化
        5.2.10 .統(tǒng)計學處理
    5.3 .結果
        5.3.1 .結腸癌裸鼠動物模型
        5.3.2 .荷瘤裸鼠生存狀況比較
        5.3.3 .對荷瘤裸鼠抑瘤的影響
        5.3.4 .荷瘤裸鼠T淋巴細胞亞群檢測結果
        5.3.5 .荷瘤裸鼠血清細胞因子檢測結果
        5.3.6 .荷瘤裸鼠腫瘤病理學檢測結果
        5.3.7 .瘤體凋亡相關蛋白Bcl-2與Bax表達結果
        5.3.8 .信號通路關鍵基因表達水平的結果
    5.4 .討論
        5.4.1 .結腸癌治療面臨的挑戰(zhàn)
        5.4.2 .結腸癌干細胞荷瘤裸鼠治療的實驗研究
        5.4.3 .荷瘤裸鼠實驗作用機制的研究
    5.5 .本章小結
第6章 結論
    6.1 .結論
    6.2 .創(chuàng)新點
    6.3 .展望
參考文獻
附錄
    附錄A
    附錄B
    附錄C
發(fā)表論文獲獎和參加科研情況說明
致謝

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 吳紅霞;鄭繪霞;梁建芳;;Wnt信號通路中GSK-3β和CD44v6在人結直腸腫瘤組織中的表達及意義[J];山西醫(yī)科大學學報;2015年12期

2 孫雯雯;沈娜;竇金霞;劉子艷;梁佩芬;高文遠;;自然殺傷細胞和自然殺傷T細胞對結腸癌HT29細胞干細胞的體外殺傷實驗研究[J];中國慢性病預防與控制;2015年12期

3 鄭敏;謝琳娜;曾燕華;林德馨;;CD44、CD133及EpCAM與肝癌細胞成瘤性及耐藥性的相關性[J];中國老年學雜志;2015年23期

4 崔海燕;張恒明;張磊;李建釗;許峰;;青年大腸癌85例發(fā)病與病理特點分析[J];大家健康(學術版);2015年21期

5 花瑋;岳琪;全凱;張海波;史之峰;陳亮;;CD133陽性人腦膠質(zhì)瘤干細胞增殖特點分析[J];中國臨床神經(jīng)科學;2015年06期

6 姜林鶴;宋云駿;;腫瘤干細胞標志物CD133在大腸癌組織中的表達及意義[J];河北醫(yī)學;2015年10期

7 劉大晗;王建軍;;針刺造影P-糖蛋白抑制胃腸腫瘤耐藥作用分析[J];科技通報;2015年10期

8 劉紅;王玉凈;邊磊;黎海莉;房朝暉;吳小華;程建新;;CD44~+/CD24~+表型的宮頸癌Siha細胞對順鉑的耐藥及機制研究[J];中國癌癥雜志;2015年10期

9 華云旗;毋永娟;譚亞琴;劉麗萍;巴彩霞;;CD44、CD24在結直腸癌和腺瘤中的表達及其致瘤和侵襲能力的研究[J];內(nèi)蒙古醫(yī)科大學學報;2015年05期

10 柯少迎;;結腸癌患者外周血單核細胞CD24表達的檢測及意義[J];福建醫(yī)藥雜志;2015年04期

本文編號：2840417