目的:通過(guò)藥理學(xué)方法,篩選山豆根主要生物堿對(duì)免疫性肝損傷小鼠起干預(yù)作用的活性成分,再通過(guò)分子生物學(xué)方法進(jìn)一步考察主要生物堿對(duì)NK細(xì)胞及其表面活化型受體NKG2D影響,旨在考察山豆根主要生物堿可通過(guò)抑制NK細(xì)胞的活化,從而干預(yù)免疫性肝損傷作用。方法:采用自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠血清中ALT、AST的含量變化,結(jié)合HE染色檢測(cè)肝臟損傷情況,篩選出山豆根中起干預(yù)作用的活性成分氧化苦參堿和槐果堿。通過(guò)小鼠血清中ALB、CHE及TP改變、Tunnel染色檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況、免疫球蛋白水平及炎性因子改變情況,進(jìn)一步確證氧化苦參堿和槐果堿對(duì)免疫性肝損傷小鼠的干預(yù)作用。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞數(shù)及NK細(xì)胞表面受體NKG2D和CRACC;免疫印跡(Western bloting)檢測(cè)NKG2A、NKG2D、DAP10、DAP12;免疫印跡和免疫組化聯(lián)合檢測(cè)PI3K、AKT和ERK;以及實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)(Q-PCR)NKG2A、NKG2D、DAP10、DAP12、PI3K、AKT、ERK、ZAP70和Syk,旨在考察氧化苦參堿和槐果堿干預(yù)免疫性肝損傷的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果:(1)山豆根中抗免疫性肝損傷的活性成分篩選采用poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型為研究對(duì)象,以小鼠血清中ALT、AST和病理狀態(tài)為指標(biāo),篩選山豆根中具有對(duì)小鼠免疫性肝損傷起到干預(yù)作用的生物堿。研究發(fā)現(xiàn),山豆根中氧化苦參堿和槐果堿能顯著降低poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)小鼠血清中ALT、AST水平(P0.05,P0.01),且高劑量?jī)?yōu)于低劑量,表明氧化苦參堿和槐果堿可改善poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷。病理組織學(xué)結(jié)果表明氧化苦參堿和槐果堿高劑量均能明顯緩解polyⅠ:C/D-GalN造成的肝損傷,而兩者的低劑量預(yù)處理后能輕微減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷,苦參堿并不具有上述干預(yù)作用。綜上,除苦參堿外,氧化苦參堿和槐果堿對(duì)小鼠免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。(2)氧化苦參堿抗免疫性肝損傷作用機(jī)制研究通過(guò)檢測(cè)小鼠血清中ALB、CHE和TP。結(jié)果顯示,模型組ALB、CHE和TP均低于空白組(p0.01);給藥組ALB、CHE、TP均上調(diào)(p0.01,p0.05),且高劑量?jī)?yōu)于低劑量。Tunel染色試驗(yàn)結(jié)果表明,相比于模型組,實(shí)驗(yàn)組可降低肝細(xì)胞凋亡。采用ProcartaPlex多重檢測(cè)考察小鼠血清中TNF-α和IL-18水平以及免疫球蛋白lgG、lgM和lgA濃度,發(fā)現(xiàn)給藥后,均有所改善(p0.01,p0.05)。結(jié)合小鼠肝組織中炎癥因子IL-12和INF-γmRNA水平變化,提示氧化苦參堿對(duì)免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。研究采用流式細(xì)胞術(shù),發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝臟中,NK細(xì)胞所占比例比空白組高(p0.01),小鼠脾臟中,NK細(xì)胞所占比例低于空白組(p0.05);相較于模型組,給藥組小鼠肝臟中NK細(xì)胞所占比例低于模型組,且高于空白組(p0.01,p0.05)。小鼠脾臟中,NK細(xì)胞所占比例比模型組高,比空白組低(p0.05)。結(jié)合文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示小鼠肝臟中的NK細(xì)胞是自身的活化,以及脾臟中NK細(xì)胞向肝臟遷移,使其聚集于肝臟,進(jìn)而導(dǎo)致免疫性肝損傷,而氧化苦參堿能抑制NK細(xì)胞的激活及遷移,進(jìn)而達(dá)到干預(yù)肝損傷的作用。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析得到,模型組NK細(xì)胞表面活化性受體NKG2D和CRACC的表達(dá)量均高于空白組。給藥后,氧化苦參堿組NKG2D的表達(dá)明顯下調(diào),氧化苦參堿對(duì)活化性受體CRACC的作用不明顯。同時(shí),采用Western blot和Q-PCR發(fā)現(xiàn),氧化苦參堿對(duì)抑制性受體NKG2A的作用不明顯。結(jié)果提示:氧化苦參堿對(duì)免疫性肝損傷的干預(yù)作用,可能是通過(guò)下調(diào)NKG2D的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。采用Q-PCR,發(fā)現(xiàn)poly I:C/D-GalN處理后,NKG2D、DAP10、AKT以及PI3K mRNA水平均升高(p0.01,p0.05);給藥后,NKG2D表達(dá)降低的同時(shí),DAP10、AKT以及PI3K的核酸水平均降低(p0.01,p0.05);通過(guò)Western blot和免疫組化可知,poly I:C/D-GalN處理后,NKG2D的適配體蛋白DAP10及其下游蛋白均升高(p0.01,p0.05);給藥后,DAP10及其下游蛋白的表達(dá)量均降低(p0.01,p0.05);結(jié)果顯示:氧化苦參堿可能是通過(guò)抑制NKG2D的表達(dá),從而影響DAP10下游蛋白,達(dá)到抑制NK細(xì)胞活性的作用。(3)槐果堿抗免疫性肝損傷作用機(jī)制研究建立poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型,考察槐果堿對(duì)免疫性肝損傷小鼠的干預(yù)作用。研究發(fā)現(xiàn),槐果堿可增加ALB、CHE、TP含量(p0.01,p0.05),降低肝組織中TNF-α、INF-γ、IL-12的mRNA水平(p0.01,p0.05),結(jié)合Tunel染色結(jié)果,發(fā)現(xiàn)槐果堿對(duì)免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)模型組小鼠肝組織中NK細(xì)胞數(shù),發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞所占淋巴總細(xì)胞的比例高于空白組;給藥后均降低。且給藥組NK細(xì)胞表面活化型受體NKG2D的表達(dá)量低于模型組。通過(guò)Western blot和Q-PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)模型組DAP12、ZAP70以及Syk均高于空白組(p0.01,p0.05);槐果堿預(yù)處理后DAP12、ZAP70以及Syk均降低(p0.01,p0.05);結(jié)果提示:槐果堿可通過(guò)NKG2D-DAP12通路降低NK細(xì)胞的活化,從而達(dá)到緩解肝損傷的作用。結(jié)論:本研究表明,山豆根中氧化苦參堿和槐果堿能明顯改善小鼠肝損傷情況,其作用機(jī)制是藥物通過(guò)抑制NK細(xì)胞的活性實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1 山豆根中主要生物堿對(duì)免疫性肝損傷小鼠生化指標(biāo)的影響（n=10）注：Control：空白組；PD：模型組；MH：苦參堿高劑量組；ML：苦參堿低劑量組；OH：氧化苦參堿高劑量組；OL：氧化苦參堿低劑量組；SH：槐果堿高劑量組；SL：槐果堿低劑量組。與空白組相比，#p<0.05，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01。3.2 主要生物堿對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝組織的影響肝組織病理學(xué)顯示（圖 2），空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞排列規(guī)則，未見(jiàn)細(xì)胞變性、壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。經(jīng) polyI:C/D-GalN 刺激后，肝組織有明顯的出血性病變。病變表現(xiàn)為小葉壞死，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞膨脹，壞死和裂解等情況。氧化苦參堿和槐果堿高劑量能明顯緩解 polyI:C/D-GalN 造成的肝損傷。而氧化苦參堿和槐果堿低劑量預(yù)處理后，能輕微的減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織的損傷。同時(shí)，苦參堿高劑量和苦參堿低劑量均不能緩解炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)以及組織的損傷。結(jié)果提示，氧化苦參堿和槐果堿可改善 poly I:C/D-GalN 誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的病理變化。

8圖 2 山豆根中主要生物堿干預(yù)免疫性肝損傷的病理切片觀察（HE：200 倍和 400 倍） （n=5）注：Control：空白組；PD：模型組；OH：氧化苦參堿高劑量組；OL：氧化苦參堿低劑量組；SH：槐果堿高劑量組；SL：槐果堿低劑量組；MH：苦參堿高劑量組；ML：苦參堿低劑量組。

圖 3 氧化苦參堿對(duì)免疫性肝損傷小鼠血清中 ALB、CHE、TP 的影響（n=10）注：Control：空白組；PD：模型組；OH：氧化苦參堿高劑量組；OL：氧化苦參堿低劑量組；與空白組相比，#p<0.05，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01。
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本文編號(hào)：2840420