目的:通過藥理學方法,篩選山豆根主要生物堿對免疫性肝損傷小鼠起干預作用的活性成分,再通過分子生物學方法進一步考察主要生物堿對NK細胞及其表面活化型受體NKG2D影響,旨在考察山豆根主要生物堿可通過抑制NK細胞的活化,從而干預免疫性肝損傷作用。方法:采用自動生化儀檢測小鼠血清中ALT、AST的含量變化,結(jié)合HE染色檢測肝臟損傷情況,篩選出山豆根中起干預作用的活性成分氧化苦參堿和槐果堿。通過小鼠血清中ALB、CHE及TP改變、Tunnel染色檢測肝細胞凋亡情況、免疫球蛋白水平及炎性因子改變情況,進一步確證氧化苦參堿和槐果堿對免疫性肝損傷小鼠的干預作用。通過流式細胞技術(shù)檢測NK細胞數(shù)及NK細胞表面受體NKG2D和CRACC;免疫印跡(Western bloting)檢測NKG2A、NKG2D、DAP10、DAP12;免疫印跡和免疫組化聯(lián)合檢測PI3K、AKT和ERK;以及實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)(Q-PCR)NKG2A、NKG2D、DAP10、DAP12、PI3K、AKT、ERK、ZAP70和Syk,旨在考察氧化苦參堿和槐果堿干預免疫性肝損傷的相關機制。結(jié)果:(1)山豆根中抗免疫性肝損傷的活性成分篩選采用poly I:C/D-GalN誘導小鼠免疫性肝損傷模型為研究對象,以小鼠血清中ALT、AST和病理狀態(tài)為指標,篩選山豆根中具有對小鼠免疫性肝損傷起到干預作用的生物堿。研究發(fā)現(xiàn),山豆根中氧化苦參堿和槐果堿能顯著降低poly I:C/D-GalN誘導小鼠血清中ALT、AST水平(P0.05,P0.01),且高劑量優(yōu)于低劑量,表明氧化苦參堿和槐果堿可改善poly I:C/D-GalN誘導的小鼠免疫性肝損傷。病理組織學結(jié)果表明氧化苦參堿和槐果堿高劑量均能明顯緩解polyⅠ:C/D-GalN造成的肝損傷,而兩者的低劑量預處理后能輕微減少炎性細胞浸潤和組織損傷,苦參堿并不具有上述干預作用。綜上,除苦參堿外,氧化苦參堿和槐果堿對小鼠免疫性肝損傷具有保護作用。(2)氧化苦參堿抗免疫性肝損傷作用機制研究通過檢測小鼠血清中ALB、CHE和TP。結(jié)果顯示,模型組ALB、CHE和TP均低于空白組(p0.01);給藥組ALB、CHE、TP均上調(diào)(p0.01,p0.05),且高劑量優(yōu)于低劑量。Tunel染色試驗結(jié)果表明,相比于模型組,實驗組可降低肝細胞凋亡。采用ProcartaPlex多重檢測考察小鼠血清中TNF-α和IL-18水平以及免疫球蛋白lgG、lgM和lgA濃度,發(fā)現(xiàn)給藥后,均有所改善(p0.01,p0.05)。結(jié)合小鼠肝組織中炎癥因子IL-12和INF-γmRNA水平變化,提示氧化苦參堿對免疫性肝損傷具有保護作用。研究采用流式細胞術(shù),發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝臟中,NK細胞所占比例比空白組高(p0.01),小鼠脾臟中,NK細胞所占比例低于空白組(p0.05);相較于模型組,給藥組小鼠肝臟中NK細胞所占比例低于模型組,且高于空白組(p0.01,p0.05)。小鼠脾臟中,NK細胞所占比例比模型組高,比空白組低(p0.05)。結(jié)合文獻和實驗結(jié)果,提示小鼠肝臟中的NK細胞是自身的活化,以及脾臟中NK細胞向肝臟遷移,使其聚集于肝臟,進而導致免疫性肝損傷,而氧化苦參堿能抑制NK細胞的激活及遷移,進而達到干預肝損傷的作用。運用流式細胞術(shù)分析得到,模型組NK細胞表面活化性受體NKG2D和CRACC的表達量均高于空白組。給藥后,氧化苦參堿組NKG2D的表達明顯下調(diào),氧化苦參堿對活化性受體CRACC的作用不明顯。同時,采用Western blot和Q-PCR發(fā)現(xiàn),氧化苦參堿對抑制性受體NKG2A的作用不明顯。結(jié)果提示:氧化苦參堿對免疫性肝損傷的干預作用,可能是通過下調(diào)NKG2D的表達來實現(xiàn)。采用Q-PCR,發(fā)現(xiàn)poly I:C/D-GalN處理后,NKG2D、DAP10、AKT以及PI3K mRNA水平均升高(p0.01,p0.05);給藥后,NKG2D表達降低的同時,DAP10、AKT以及PI3K的核酸水平均降低(p0.01,p0.05);通過Western blot和免疫組化可知,poly I:C/D-GalN處理后,NKG2D的適配體蛋白DAP10及其下游蛋白均升高(p0.01,p0.05);給藥后,DAP10及其下游蛋白的表達量均降低(p0.01,p0.05);結(jié)果顯示:氧化苦參堿可能是通過抑制NKG2D的表達,從而影響DAP10下游蛋白,達到抑制NK細胞活性的作用。(3)槐果堿抗免疫性肝損傷作用機制研究建立poly I:C/D-GalN誘導小鼠免疫性肝損傷模型,考察槐果堿對免疫性肝損傷小鼠的干預作用。研究發(fā)現(xiàn),槐果堿可增加ALB、CHE、TP含量(p0.01,p0.05),降低肝組織中TNF-α、INF-γ、IL-12的mRNA水平(p0.01,p0.05),結(jié)合Tunel染色結(jié)果,發(fā)現(xiàn)槐果堿對免疫性肝損傷具有保護作用。流式細胞技術(shù)檢測模型組小鼠肝組織中NK細胞數(shù),發(fā)現(xiàn)NK細胞所占淋巴總細胞的比例高于空白組;給藥后均降低。且給藥組NK細胞表面活化型受體NKG2D的表達量低于模型組。通過Western blot和Q-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)模型組DAP12、ZAP70以及Syk均高于空白組(p0.01,p0.05);槐果堿預處理后DAP12、ZAP70以及Syk均降低(p0.01,p0.05);結(jié)果提示:槐果堿可通過NKG2D-DAP12通路降低NK細胞的活化,從而達到緩解肝損傷的作用。結(jié)論:本研究表明,山豆根中氧化苦參堿和槐果堿能明顯改善小鼠肝損傷情況,其作用機制是藥物通過抑制NK細胞的活性實現(xiàn)的。
【學位單位】：成都中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1 山豆根中主要生物堿對免疫性肝損傷小鼠生化指標的影響（n=10）注：Control：空白組；PD：模型組；MH：苦參堿高劑量組；ML：苦參堿低劑量組；OH：氧化苦參堿高劑量組；OL：氧化苦參堿低劑量組；SH：槐果堿高劑量組；SL：槐果堿低劑量組。與空白組相比，#p<0.05，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01。3.2 主要生物堿對免疫性肝損傷小鼠肝組織的影響肝組織病理學顯示（圖 2），空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細胞排列規(guī)則，未見細胞變性、壞死和炎性細胞浸潤等病理變化。經(jīng) polyI:C/D-GalN 刺激后，肝組織有明顯的出血性病變。病變表現(xiàn)為小葉壞死，免疫細胞浸潤和肝細胞膨脹，壞死和裂解等情況。氧化苦參堿和槐果堿高劑量能明顯緩解 polyI:C/D-GalN 造成的肝損傷。而氧化苦參堿和槐果堿低劑量預處理后，能輕微的減少炎性細胞浸潤和組織的損傷。同時，苦參堿高劑量和苦參堿低劑量均不能緩解炎性細胞的浸潤以及組織的損傷。結(jié)果提示，氧化苦參堿和槐果堿可改善 poly I:C/D-GalN 誘導的小鼠免疫性肝損傷的病理變化。

8圖 2 山豆根中主要生物堿干預免疫性肝損傷的病理切片觀察（HE：200 倍和 400 倍） （n=5）注：Control：空白組；PD：模型組；OH：氧化苦參堿高劑量組；OL：氧化苦參堿低劑量組；SH：槐果堿高劑量組；SL：槐果堿低劑量組；MH：苦參堿高劑量組；ML：苦參堿低劑量組。

圖 3 氧化苦參堿對免疫性肝損傷小鼠血清中 ALB、CHE、TP 的影響（n=10）注：Control：空白組；PD：模型組；OH：氧化苦參堿高劑量組；OL：氧化苦參堿低劑量組；與空白組相比，#p<0.05，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01。
【參考文獻】

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1 趙晨翔;張雅敏;劉宏勝;;單味中藥對免疫性肝損傷保護作用實驗研究進展[J];中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志;2015年05期

2 申弘;聶紅明;葉青艷;陳建杰;;免疫性肝損傷動物模型研究進展[J];肝臟;2014年10期

3 趙華俊;林昂;韓秋菊;張建;;TLR4通路對polyI:C誘導肝癌細胞凋亡的影響[J];中國免疫學雜志;2014年01期

4 伍艷玲;;苦參堿葡萄糖注射液治療病毒性肝炎的療效觀察[J];現(xiàn)代診斷與治療;2013年06期

5 徐潔;馬超英;文麗梅;車玉梅;;山豆根的研究進展[J];中華中醫(yī)藥學刊;2012年11期

6 周明眉;楊紅舟;趙愛華;范自全;祝路;賈偉;;山豆根非生物堿部分對小鼠免疫功能的影響[J];時珍國醫(yī)國藥;2011年12期

7 羅娟;薛天陽;許偉;高吉照;;苦參堿對人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞的作用及機制[J];中華小兒外科雜志;2011年09期

8 戴五好;錢利武;楊士友;周國勤;;苦參、山豆根植物中主要生物堿藥學研究進展[J];安徽醫(yī)藥;2011年09期

9 ;Roles of liver innate immune cells in nonalcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2010年37期

10 劉松燦;彭勃;;免疫性肝損傷的研究進展[J];光明中醫(yī);2009年10期

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1 王靜;小鼠肝臟免疫系統(tǒng)對自身免疫性肝損傷的調(diào)節(jié)機制[D];中國科學技術(shù)大學;2006年

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1 錢慧;槐果堿抗實驗性大鼠肝纖維化作用及機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2008年

2 尹龍萍;中藥山豆根降酶護肝活性部位研究[D];上海交通大學;2007年

本文編號：2840420