背景與目的1型單純皰疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)是以人類為唯一宿主的DNA雙鏈病毒。人群感染非常普遍,容易引起潛伏感染。該病毒主要引起皮膚粘膜感染,免疫力低下者可導(dǎo)致多器官損害甚至腫瘤。目前,臨床上使用的抗HSV藥物為核苷類似物,如阿昔洛韋、更昔洛韋。由于耐藥現(xiàn)象以及毒副作用的限制,開發(fā)研究新的抗病毒藥物尤為重要。中草藥是發(fā)掘新藥的一個(gè)巨大寶藏。本研究擬從中草藥單體中篩選抗單純皰疹病毒有效的藥物候選分子。篩選抗病毒藥物有兩條基本策略:一是以完整病毒為靶標(biāo)篩選抗病毒復(fù)制的藥物;二是以病毒的重要結(jié)構(gòu)或功能性分子為靶標(biāo),篩選抗病毒復(fù)制的藥物。前期我們以HSV-1完整病毒顆粒為靶標(biāo),在細(xì)胞水平進(jìn)行大量的藥物篩選后發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿和金絲桃素有較好的抗HSV-1復(fù)制的潛能,且金絲桃素具有更優(yōu)的抗病毒作用。在此基礎(chǔ)之上,本研究擬進(jìn)一步探索金絲桃素抗病毒復(fù)制的作用機(jī)制。首先,通過對(duì)金絲桃素干擾HSV-1病毒的吸附、穿膜及基因轉(zhuǎn)錄的研究,探尋其抗HSV-1病毒的作用階段。其次,通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)金絲桃素與HSV-1病毒復(fù)制關(guān)鍵蛋白堿性核酸酶(AN)可能發(fā)生相互作用,進(jìn)而真核表達(dá)獲得具有活性的重組AN蛋白,并對(duì)金絲桃素能否抑制其活性進(jìn)行驗(yàn)證,以期較深入的解析金絲桃素抗HSV-1病毒的作用機(jī)制。同時(shí),證實(shí)以AN分子為靶標(biāo)可建立抗HSV-1病毒的“分子篩選模型”,為大規(guī)模從中草藥單體中篩選有效抗病毒的候選藥物奠定基礎(chǔ)。方法1.金絲桃素抗HSV-1的藥效學(xué)研究:不同濃度的金絲桃素(20、15、10、52.5和1.25μmol/L)溶液處理Vero細(xì)胞,通過MTT法檢測(cè)其對(duì)Vero細(xì)胞的毒性作用;Reed-Muench法[1]計(jì)算HSV-1的病毒滴度;用HSV-1感染Vero細(xì)胞,通過細(xì)胞病變效應(yīng)法(cytopathic effect,CPE)和空斑減數(shù)法(plaque reduction assay,PRA)檢測(cè)金絲桃素抗HSV-1病毒的藥物效應(yīng)。2.金絲桃素抗HSV-1作用的機(jī)制研究:金絲桃素作用于HSV-1感染的吸附及穿入階段,探討其對(duì)HSV-1吸附及穿入宿主細(xì)胞的影響;RT-q PCR和Westernblotting考察金絲桃素的作用機(jī)理。3.HSV-1病毒AN的表達(dá)及金絲桃素對(duì)AN活性的抑制作用:通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)金絲桃素與AN的相互作用及其互作位點(diǎn);巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)AN,Ni-NTA親和層析進(jìn)行純化,檢測(cè)純化后AN的核酸外切酶活性;最后,檢測(cè)金絲桃素對(duì)AN活性的抑制作用。結(jié)果1.金絲桃素抗HSV-1的藥效學(xué)研究:金絲桃素的半數(shù)中毒濃度(TC50)是17.02μmol/L,藥物對(duì)病毒的半數(shù)有效濃度(IC50)是2.6μmol/L,選擇性指數(shù)(selectivity index,SI)是6.55;HSV-1的病毒滴度為10-5.7;CPE法和PRA法檢測(cè)金絲桃素有明顯抑制HSV-1復(fù)制的作用。2.金絲桃素抗HSV-1作用的機(jī)制研究:金絲桃素可抑制HSV-1對(duì)宿主細(xì)胞的吸附及穿入;RT-q PCR結(jié)果表明金絲桃素可明顯抑制HSV-1 ICP27 m RNA、ICP8m RNA、g D m RNA、UL12和UL53基因的表達(dá);Western blotting結(jié)果顯示金絲桃素可抑制病毒蛋白ICP4、ICP8和g D的表達(dá)。3.HSV-1堿性核酸酶AN的表達(dá)及金絲桃素對(duì)其活性抑制作用的研究:生物信息學(xué)預(yù)測(cè)金絲桃素與AN蛋白酶活性中心可發(fā)生相互作用,金絲桃素對(duì)AN的活性有潛在的抑制作用;通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)目的蛋白AN,親和層析大量表達(dá)的AN獲得了純度較高的重組AN蛋白;酶活性檢測(cè)AN具有明顯的核酸外切酶活性,而金絲桃素可明顯抑制其活性。結(jié)論1.金絲桃素有明顯抑制HSV-1復(fù)制的作用。2.金絲桃素通過抑制病毒感染的多個(gè)階段發(fā)揮抗病毒作用。3.通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析金絲桃素與AN蛋白酶活性中心可發(fā)生相互作用;巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了目的蛋白AN,純度約85%;酶活性檢測(cè)具有明顯的核酸外切酶活性;金絲桃素明顯抑制AN的活性作用。
【學(xué)位單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

第一部分 金絲桃素抗 HSV-1 作用的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究第一部分 金絲桃素抗 HSV-1 作用的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究材料與儀器藥物桃素購于上海源葉生物科技公司，純度：98%，批號(hào)：PAO0408R素用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配成 30mmol/L 母液濃度，用 除菌后存于 4℃避光，使用前用 DMEM 培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。液相層析鑒定（圖 1-1）。注射用阿昔洛韋（ACV），購于湖北潛：1411201。將 ACV 同上的方法配成 30mmol/L 母液濃度，過濾使用前用 DMEM 培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。實(shí)驗(yàn)中所用藥物的 DM。

圖 1-2 金絲桃素對(duì) Vero 細(xì)胞的毒性Fig.1-2 Toxicity of hypericin to Vero cells3.2 病毒滴度測(cè)定將病毒原液連續(xù) 10 倍傳遞稀釋后接種于細(xì)胞，每日觀察病毒感染 Vero 細(xì)胞后CPE 的病變情況，72h 記錄結(jié)果（圖 1-3，表 1-1）。

圖 1-2 金絲桃素對(duì) Vero 細(xì)胞的毒性Fig.1-2 Toxicity of hypericin to Vero cells3.2 病毒滴度測(cè)定將病毒原液連續(xù) 10 倍傳遞稀釋后接種于細(xì)胞，每日觀察病毒感染 Vero 細(xì)胞后CPE 的病變情況，72h 記錄結(jié)果（圖 1-3，表 1-1）。

本文編號(hào)：2840032