背景與目的1型單純皰疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)是以人類為唯一宿主的DNA雙鏈病毒。人群感染非常普遍,容易引起潛伏感染。該病毒主要引起皮膚粘膜感染,免疫力低下者可導致多器官損害甚至腫瘤。目前,臨床上使用的抗HSV藥物為核苷類似物,如阿昔洛韋、更昔洛韋。由于耐藥現象以及毒副作用的限制,開發(fā)研究新的抗病毒藥物尤為重要。中草藥是發(fā)掘新藥的一個巨大寶藏。本研究擬從中草藥單體中篩選抗單純皰疹病毒有效的藥物候選分子。篩選抗病毒藥物有兩條基本策略:一是以完整病毒為靶標篩選抗病毒復制的藥物;二是以病毒的重要結構或功能性分子為靶標,篩選抗病毒復制的藥物。前期我們以HSV-1完整病毒顆粒為靶標,在細胞水平進行大量的藥物篩選后發(fā)現鹽酸小檗堿和金絲桃素有較好的抗HSV-1復制的潛能,且金絲桃素具有更優(yōu)的抗病毒作用。在此基礎之上,本研究擬進一步探索金絲桃素抗病毒復制的作用機制。首先,通過對金絲桃素干擾HSV-1病毒的吸附、穿膜及基因轉錄的研究,探尋其抗HSV-1病毒的作用階段。其次,通過生物信息學分析預測金絲桃素與HSV-1病毒復制關鍵蛋白堿性核酸酶(AN)可能發(fā)生相互作用,進而真核表達獲得具有活性的重組AN蛋白,并對金絲桃素能否抑制其活性進行驗證,以期較深入的解析金絲桃素抗HSV-1病毒的作用機制。同時,證實以AN分子為靶標可建立抗HSV-1病毒的“分子篩選模型”,為大規(guī)模從中草藥單體中篩選有效抗病毒的候選藥物奠定基礎。方法1.金絲桃素抗HSV-1的藥效學研究:不同濃度的金絲桃素(20、15、10、52.5和1.25μmol/L)溶液處理Vero細胞,通過MTT法檢測其對Vero細胞的毒性作用;Reed-Muench法[1]計算HSV-1的病毒滴度;用HSV-1感染Vero細胞,通過細胞病變效應法(cytopathic effect,CPE)和空斑減數法(plaque reduction assay,PRA)檢測金絲桃素抗HSV-1病毒的藥物效應。2.金絲桃素抗HSV-1作用的機制研究:金絲桃素作用于HSV-1感染的吸附及穿入階段,探討其對HSV-1吸附及穿入宿主細胞的影響;RT-q PCR和Westernblotting考察金絲桃素的作用機理。3.HSV-1病毒AN的表達及金絲桃素對AN活性的抑制作用:通過生物信息學分析預測金絲桃素與AN的相互作用及其互作位點;巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)表達AN,Ni-NTA親和層析進行純化,檢測純化后AN的核酸外切酶活性;最后,檢測金絲桃素對AN活性的抑制作用。結果1.金絲桃素抗HSV-1的藥效學研究:金絲桃素的半數中毒濃度(TC50)是17.02μmol/L,藥物對病毒的半數有效濃度(IC50)是2.6μmol/L,選擇性指數(selectivity index,SI)是6.55;HSV-1的病毒滴度為10-5.7;CPE法和PRA法檢測金絲桃素有明顯抑制HSV-1復制的作用。2.金絲桃素抗HSV-1作用的機制研究:金絲桃素可抑制HSV-1對宿主細胞的吸附及穿入;RT-q PCR結果表明金絲桃素可明顯抑制HSV-1 ICP27 m RNA、ICP8m RNA、g D m RNA、UL12和UL53基因的表達;Western blotting結果顯示金絲桃素可抑制病毒蛋白ICP4、ICP8和g D的表達。3.HSV-1堿性核酸酶AN的表達及金絲桃素對其活性抑制作用的研究:生物信息學預測金絲桃素與AN蛋白酶活性中心可發(fā)生相互作用,金絲桃素對AN的活性有潛在的抑制作用;通過畢赤酵母表達系統(tǒng)成功表達目的蛋白AN,親和層析大量表達的AN獲得了純度較高的重組AN蛋白;酶活性檢測AN具有明顯的核酸外切酶活性,而金絲桃素可明顯抑制其活性。結論1.金絲桃素有明顯抑制HSV-1復制的作用。2.金絲桃素通過抑制病毒感染的多個階段發(fā)揮抗病毒作用。3.通過生物信息學預測分析金絲桃素與AN蛋白酶活性中心可發(fā)生相互作用;巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)成功表達了目的蛋白AN,純度約85%;酶活性檢測具有明顯的核酸外切酶活性;金絲桃素明顯抑制AN的活性作用。
【學位單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

第一部分 金絲桃素抗 HSV-1 作用的藥效學實驗研究第一部分 金絲桃素抗 HSV-1 作用的藥效學實驗研究材料與儀器藥物桃素購于上海源葉生物科技公司，純度：98%，批號：PAO0408R素用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配成 30mmol/L 母液濃度，用 除菌后存于 4℃避光，使用前用 DMEM 培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。液相層析鑒定（圖 1-1）。注射用阿昔洛韋（ACV），購于湖北潛：1411201。將 ACV 同上的方法配成 30mmol/L 母液濃度，過濾使用前用 DMEM 培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。實驗中所用藥物的 DM。

圖 1-2 金絲桃素對 Vero 細胞的毒性Fig.1-2 Toxicity of hypericin to Vero cells3.2 病毒滴度測定將病毒原液連續(xù) 10 倍傳遞稀釋后接種于細胞，每日觀察病毒感染 Vero 細胞后CPE 的病變情況，72h 記錄結果（圖 1-3，表 1-1）。

圖 1-2 金絲桃素對 Vero 細胞的毒性Fig.1-2 Toxicity of hypericin to Vero cells3.2 病毒滴度測定將病毒原液連續(xù) 10 倍傳遞稀釋后接種于細胞，每日觀察病毒感染 Vero 細胞后CPE 的病變情況，72h 記錄結果（圖 1-3，表 1-1）。

本文編號：2840032