目的:1.通過對五味子本草文獻(xiàn)的梳理與考證,制定中華中醫(yī)藥學(xué)會“北五味”的道地藥材標(biāo)準(zhǔn)草案。2.通過對五味子藥材的化學(xué)成分的研究,為五味子藥材的質(zhì)量控制與質(zhì)量評價(jià)提供參考,建立五味子藥材的化學(xué)質(zhì)量標(biāo)志物。3.通過分子鑒定,對五味子及近緣物種進(jìn)行鑒定研究,確立五味子特有的生物學(xué)質(zhì)量標(biāo)志物。4.通過對五味子藥材的顯微組織和粉末的觀察,對五味子及南五味子的顯微特征進(jìn)行比較與分析,建立五味子藥材的形態(tài)學(xué)質(zhì)量標(biāo)志物。并制定2020版《中國藥典》的南五味子顯微鑒定標(biāo)準(zhǔn)草案。材料與方法:1.材料:2016-2017年收集于遼寧、吉林、黑龍江等三省的五味子藥材十批,陜西、河南、湖北、山西等南五味子12批;2016-2017年從遼寧鳳城移栽五味子100余株、陜西商洛移栽南五味子50余株、從湖南省懷化市移栽黑老虎20余株到遼寧省中藥藥用植物重點(diǎn)物種保存圃(遼寧,大連)。2.方法:2.1查閱有關(guān)五味子的歷史文獻(xiàn)50余篇,運(yùn)用比較分析的方法對五味子的藥用歷史進(jìn)行了梳理。2.2運(yùn)用HPLC和UPLC-MS兩種方法對五味子的化學(xué)成分進(jìn)行了分析,對五味子藥材的6種木脂素類成分進(jìn)行定性與定量分析,比較南北五味子6種木脂素類成分的含量差異。2.3五味子的分子生藥學(xué)分析方法2.3.1運(yùn)用Illumina Hiseq平臺,使用了高通量測序的方法,對南北五味子藥材混合粉末的總DNA進(jìn)行提取、擴(kuò)增、純化、制備文庫、測序,運(yùn)用Agilent Bioanalyzer對數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測,最后對測序數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。2.3.2運(yùn)用Illumina Hiseq平臺,使用二代測序和三代測序技術(shù),對五味子、南五味子、黑老虎等三種植物的新鮮葉片的葉綠體基因組DNA進(jìn)行提取、收集、片段化、建庫、擴(kuò)增、測序、數(shù)據(jù)檢測,最后對數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR、IR、系統(tǒng)進(jìn)化分析。2.3.3運(yùn)用基因組Survey技術(shù)評估五味子核基因的大小、GC含量與雜合度,分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,為全基因組de novo測序提供依據(jù)。2.4運(yùn)用顯微鏡檢技術(shù),按照藥典技術(shù)指導(dǎo)原則對南北五味子藥材組織(石蠟切片)和粉末(水合氯醛和稀甘油裝片)進(jìn)行研究,并顯微鏡下觀察、測量、拍照記錄。結(jié)果:1.經(jīng)過本草文獻(xiàn)梳理與考證,五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品。明朝《本草原始》始載“遼五味鮮紅色,久黑色”,李時珍最早劃分南北五味子,并指出“入滋補(bǔ)藥必用北產(chǎn)者良”。本課題組長期觀察的到南北五味子均具有“析霜”現(xiàn)象,并南五味子更加明顯。2.HPLC共測定五味子藥材10批,南五味子藥材12批,木脂素類成分含量結(jié)果顯示。遼寧省撫順的五味子總木脂素含量最高,為19.45 mg/g;遼寧省鳳城和桓仁地區(qū)的木脂素含量較高,五味子總木脂素的平均含量在15 mg/g左右;UPLC-MS測定結(jié)果為顯微化學(xué)成分的分析提供了基礎(chǔ)。3.運(yùn)用高通量測序?qū)δ媳蔽逦蹲铀幉幕旌戏勰┑腎TS2序列進(jìn)行了分析研究,結(jié)果得到37601條ITS2序列,劃分為196個OTU,并成功分析出南北五味子各自的OTU代表序列,由此成功鑒定出南北五味子藥材;對五味子、南五味子、黑老虎三種植物的葉綠體基因組測序得到三者的葉綠體基因組全長分別為146875 bp、146842 bp、145399 bp。對葉綠體基因進(jìn)行了注釋并對物種間的基因差異進(jìn)行了比較,得到14種葉綠體內(nèi)的功能基因,并找出了三者之間的差別,IR區(qū)邊界分析得到三者的rps16和petB和rpl16和clpP等基因的長度和距離邊界的位置的區(qū)別,SSR的核苷酸類別及數(shù)量等信息都可以表明三者物種間的差異等;核基因Survey雜合度的評估結(jié)果得到50Gb的基因數(shù)據(jù),我們推算五味子的核基因大小約9 Gb,為之后五味子核基因de novo測序奠定了基礎(chǔ)。4.通過顯微鑒定分析,我們得到南北五味子藥材的共同特征有相同結(jié)構(gòu)的種皮表皮石細(xì)胞、種皮內(nèi)層石細(xì)胞,不同點(diǎn)在于南五味子在中果皮細(xì)胞中含有簇晶方晶,五味子沒有,五味子的果皮表皮細(xì)胞的垂周壁呈連珠狀增厚,南五味子不明顯,由這些特點(diǎn)我們可以用來鑒定兩者,并制定了2020版《中國藥典》南五味子的顯微標(biāo)準(zhǔn)草案。結(jié)論:1.梳理了五味子的藥用歷史,制定了道地藥材“北五味”的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)草案,為五味子栽培和開發(fā)等產(chǎn)業(yè)的良好發(fā)展提供了依據(jù),也為“遼五味”的道地藥材的標(biāo)準(zhǔn)制定提供了參考。2.五味子的化學(xué)成化學(xué)質(zhì)量標(biāo)志物研究測定了22批南北五味子為五味子木脂素的含量,為五味子的化學(xué)質(zhì)量標(biāo)志物的測定與五味子藥材的質(zhì)量評價(jià)提供理論數(shù)據(jù)。3.五味子分子鑒定結(jié)論3.1高通量測序技術(shù)能準(zhǔn)確的鑒定南北五味子混合藥材粉末,為混合藥材粉末的鑒定提供了新思路。3.2首次對南五味子的葉綠體全基因組進(jìn)行了測序與分析,并將南五味子的葉綠體基因組上傳至NCBI(SRX4282569)。運(yùn)用葉綠體基因組成功鑒定出五味子及近緣物種,為葉綠體作為超級DNA條形碼用于鑒定分析近緣藥用植物提供了參考。3.3首次對五味子核基因Survey分析,得到了五味子的基因大小在9 Gb左右,為后續(xù)五味子的核基因測序提供了參考。4.南北五味子的顯微結(jié)構(gòu)分析得到,兩者可通過果皮表皮細(xì)胞是否有連珠狀增厚和是否含有簇晶方晶鑒定,首次為2020版《中國藥典》制定出了南五味子的顯微鑒定標(biāo)準(zhǔn)草案。
【學(xué)位單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R284.1
【部分圖文】：

A B C圖 2-1 古籍中的五味子特征圖A 《本草圖經(jīng) 》B 《植物實(shí)名圖考》C 《本草原始》1.3 五味子的產(chǎn)地變遷與歷代品質(zhì)評價(jià)《名醫(yī)別錄》中記載了五味子的產(chǎn)地，“生齊山山谷及代郡。八月采實(shí)，陰第一出高麗”，高麗為高句麗，為今東北地區(qū)和朝鮮地區(qū)，具體包括遼寧全部地林東部和黑龍江南部少部分地區(qū)�！侗静萁�(jīng)集注》：“今第一出高麗，.........次冀州，......又有建平者”。其中青州在漢代時為山東淄博一帶地區(qū)，冀州為河北建平在漢代時期，為建平郡，復(fù)稱武陵郡，為今湖南省、湖北省、貴州省、重慶西壯族自治區(qū)境。應(yīng)屬今南五味的產(chǎn)區(qū)�！侗静菅芰x》：“今華州之西至秦州皆華州和秦州為現(xiàn)今陜西地區(qū)，《本草原始》：“遼五味子鮮紅色，久黑色”。是最早的記載�！侗静莩搜虐胭省罚骸案啕愓咦顒伲又�(山西)府者歲貢，杭越間亦

圖 2-2 析霜特征圖A、遼五味(遼寧鳳城) B、南五味子(陜西商洛)討 論經(jīng)過本草文獻(xiàn)梳理與考證，我們發(fā)現(xiàn)五味子在歷史中記載的名稱既有北五味如五梅子，又有南五味如山花椒；五味子的產(chǎn)區(qū)考證明確了五味子的地道產(chǎn)區(qū)在東北靠近朝鮮的一帶區(qū)域，并且在歷史長河中，北五味一直有“第一”“最佳”等記載。五味子的采收加工也是非常重要的步驟，五味子具有良好的保健功效，并且沒有任何毒性，五味子制成的五味子膏等均可以作為平常食用的保健品，傳統(tǒng)用藥中五味子蜜制較多，2015 版《中國藥典》收錄的炮制方法有醋五味子，也是目前為了五味子保存所

圖 3-(1-2) 五味子果實(shí)橫斷面1. 外果皮 2.中果皮 3.維管束 4.內(nèi)果皮細(xì)胞 5.種皮表皮石細(xì)胞6.種皮內(nèi)層石細(xì)胞 7.油細(xì)胞層 8.種皮內(nèi)表皮細(xì)胞 9.胚乳組織4.2 粉末顯微鑒定分析本品粉末紅棕色棕至黑棕色。種皮表皮石細(xì)胞，一般成片存在，表面觀成多角形長多角形；直徑 18-40 μm，縱斷面觀呈的長方形；長約 40μm，壁厚，孔溝極細(xì)密，含棕色物或棕黑色物。種皮內(nèi)層石細(xì)胞，單個散在或附于種皮表皮石細(xì)胞層，呈卵圓形長卵圓形、多角形等多種形態(tài)。大小不一，長度可達(dá) 160 μm，紋孔和孔溝明顯。果表皮細(xì)胞表面觀呈多角形，垂周壁略呈連珠狀增厚，表面有角質(zhì)線紋，表皮中散有油胞。中果皮細(xì)胞皺縮，界限不明顯，內(nèi)含淀粉粒。見圖 3-3、表 3-2。
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本文編號：2839317