研究背景:本項(xiàng)目組既往研究顯示,芪葛顆粒對(duì)胃黏膜及肝損傷具有一定的保護(hù)作用,黃芪-葛根可以減輕乙醇對(duì)肝臟的損傷,但芪葛顆粒護(hù)肝的藥理作用未作深入探討。本研究探討芪葛顆粒防治大鼠酒精性肝損傷的作用及機(jī)制評(píng)價(jià)。目的:研究芪葛顆粒對(duì)乙醇誘導(dǎo)的大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用。通過(guò)超高壓液相色譜(UPLC-Q-TOF-MS)探討芪葛顆粒對(duì)酒精肝損傷的肝臟、血漿、尿液中內(nèi)代謝物的影響變化,明確芪葛顆粒護(hù)肝的作用機(jī)理。方法:1.建立乙醇誘導(dǎo)大鼠(亞急性)酒精性肝損傷模型,將SD大鼠隨機(jī)分成3組,每組8只,即正常組,模型組,芪葛顆粒組。芪葛顆粒組每日給予芪葛顆粒灌胃,正常組和模型組給予生理鹽水灌胃。每天除正常組外,其余各組給藥4h后均給予50%乙醇連續(xù)7天、乙醇濃度增加至60%連續(xù)3天、乙醇濃度增加至70%連續(xù)2天、乙醇濃度增加至80%連續(xù)2天,共14天。末次灌胃前9h禁食不禁水,予腹腔注射3%戊巴比妥鈉,并腹主動(dòng)脈采血觀察乙醇對(duì)生化指標(biāo)結(jié)果的影響;取肝組織,稱(chēng)重,取各組肝左葉進(jìn)行病理HE染色觀察組織損傷情況。收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P值0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.芪葛顆粒對(duì)乙醇誘導(dǎo)的大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究。建立乙醇誘導(dǎo)大鼠酒精性肝損傷模型,SD雌性大鼠,SPF級(jí),體重180~220g。隨機(jī)分成6組,分別為正常組(Normal)、酒精性肝損傷模型組(Model)、水飛薊素組(Positive control)、低量芪葛顆粒組(LQG)、中量芪葛顆粒組(MQG)、高量芪葛顆粒組(HQG)。每天LQG、MQG、HQG組經(jīng)口灌胃給予低中高劑量芪葛顆粒。正常組(Normal)和模型組(Mode])給予生理鹽水(12ml/kg)灌胃。水飛薊素組(Positive control)給予0.5%水飛薊素灌胃。將動(dòng)物每3天稱(chēng)重,以調(diào)整受試樣品劑量。除正常組(Normal)外,其余各組在分別灌胃給藥4h后均給予50%乙醇連續(xù)7天、乙醇濃度增加至60%連續(xù)3天、乙醇濃度增加至70%連續(xù)2天、乙醇濃度增加至80%連續(xù)2天,共14天。每組分別于實(shí)驗(yàn)的第7d和14d,予代謝籠收集24h尿液,放入-80℃冰箱冷凍保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前9h禁食不禁水,稱(chēng)重,按照100g體重大鼠給予3%戊巴比妥鈉0.13ml溶液腹腔注射,并腹主動(dòng)脈采血,取血4-5ml左右,取肝左葉、浸泡10%福爾馬林固定液,待進(jìn)行病例切片HE染色。取血后室溫靜置1h,待血液分層,離心取上清,-20°保存,進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè),病理組織學(xué)檢查及代謝組學(xué)分析。3.采用代謝組學(xué)UPLC-Q-TOF-MS液質(zhì)分析方法,尋找乙醇誘導(dǎo)酒精肝損傷模型肝臟、血漿、尿液中的潛在生物標(biāo)志物。建立基于生物標(biāo)志物的芪葛顆粒對(duì)大鼠酒精性肝損傷模型藥效評(píng)價(jià)系統(tǒng),確定芪葛顆治療肝損傷效作用的關(guān)鍵代謝通路。通過(guò)MarkerLynx4.1軟件,進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,第一個(gè)階段先通過(guò)PCA分析(主成分分析)在模型組與各組代謝譜區(qū)別的差異。然后,通過(guò)OPLS-DA分析(監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析),尋找模型篩選差異代謝物,模型組所得到的VIP值(變量權(quán)重值)。VIP值超過(guò)1的代謝物,說(shuō)明該代謝物在組間差異中起重要作用。使用t檢驗(yàn)中兩個(gè)獨(dú)立樣品的非參數(shù)檢驗(yàn)測(cè)試差異的顯著性,并且將統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的閾值設(shè)定為P0.05。最終選擇VIP1,且P0.05的化合物作為標(biāo)志代謝物。結(jié)果:1.大鼠均出現(xiàn)嗜睡等醉酒狀態(tài)。大鼠肝臟經(jīng)乙醇刺激后損傷嚴(yán)重,肉眼觀察肝臟發(fā)現(xiàn):模型組大鼠肝臟大小較正常組偏大,偏暗紅色,無(wú)光澤。肝臟濕重和肝指數(shù)均值都比其他組均值高。血清肝功能檢測(cè)AST、ALT和TG較其他組大鼠明顯升高。HE染色病理切片結(jié)果:提示模型組大鼠肝組織損傷明顯,見(jiàn)大量脂肪變性,多數(shù)大、小的脂肪泡,肝細(xì)胞索排列比較紊亂,肝竇少許淤血和出血,細(xì)胞腫脹明顯。2.大鼠給予芪葛顆粒后,有少數(shù)大鼠出現(xiàn)便溏情況,但是體毛、飲食、精神狀態(tài),均較肝損傷模型組有不同程度的改善。芪葛顆粒各劑量組的血清AST、ALT和TG含量均低于肝損模型組,其中的高劑量組與肝損模型對(duì)照組的差異具有顯著性。HE染色病理切片結(jié)果:芪葛顆粒低劑量組,大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常,炎性細(xì)胞增生及脂肪泡數(shù)量較模型組有所減少;芪葛顆粒中劑量組肝細(xì)胞偶見(jiàn)散在肝細(xì)胞脂肪變性,腫脹程度減輕;芪葛顆粒高劑量組肝細(xì)胞排列基本正常,肝脂肪變性、炎癥細(xì)胞程度均降低,肝組織病理變化程度明顯減輕。3.乙醇誘導(dǎo)大鼠酒精性肝損傷模型生物標(biāo)志物的確認(rèn),分析芪葛顆粒對(duì)乙醇誘導(dǎo)大鼠酒精性肝損傷模型生物標(biāo)志物的影響,探討芪葛顆粒護(hù)肝作用機(jī)理。(1)肝臟代謝組學(xué)的潛在生物標(biāo)志物,最終獲得10種生物標(biāo)志物,二十二碳六烯酸、磷酸膽堿、乙基葡萄糖醛酸苷、亞油酸、二十二碳五烯酸(22n-6,22n-3)、溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)(20:3/18:0/17:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)(20:5),作為評(píng)價(jià)芪葛顆粒對(duì)肝損傷模型的干預(yù)作用,發(fā)現(xiàn)芪葛顆粒對(duì)其中7種生物標(biāo)志物,二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸(22n-6/22n-3)、亞油酸、溶血磷脂酰膽堿(20:3/18:0/17:0)具有調(diào)節(jié)恢復(fù)作用,其中3個(gè)生物標(biāo)志物,溶血磷脂酰膽堿(20:3)、亞油酸、二十二碳五烯酸(22n-6)具有顯著調(diào)節(jié)作用(P0.05)。芪葛顆粒干預(yù)肝損傷模型組大鼠藥效作用的關(guān)鍵通路主要為亞油酸代謝通路。(2)血清代謝組學(xué)的潛在生物標(biāo)志物,最終獲得27個(gè)變量(25種生物標(biāo)志物),乙基葡萄糖醛酸苷、二十二碳六烯酸、油酸酰胺、21-羥基孕烯醇酮、L-乙�；鈮A、四氫脫氧皮質(zhì)醇、二十二碳五烯酸(22n-6)、腎上腺酸、色氨酸、亞麻酸、油酸、5-氫基戊酸、花生四烯酸、溶血磷脂酰膽堿(16:1/20:1/20:3/16:0/18:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(22:1/16:0/22:6/18:0)、色氨酸,作為評(píng)價(jià)芪葛顆粒對(duì)肝損傷模型的干預(yù)作用,發(fā)現(xiàn)芪葛顆粒對(duì)其中8種生物標(biāo)志物,溶血磷脂酰膽堿(20:1)、二十二碳六烯酸、四氫脫氧皮質(zhì)醇、溶血磷脂酰乙醇胺(22:1/16:0)、腎上腺酸、亞麻酸、油酸具有調(diào)節(jié)恢復(fù)作用,其中油酸具有顯著調(diào)節(jié)作用(P0.05)。芪葛顆粒干預(yù)肝損傷模型組大鼠藥效作用的關(guān)鍵通路主要為甘油磷脂代謝、色氨酸代謝、花生四烯酸代謝通路。(3)尿液代謝組學(xué)的潛在生物標(biāo)志物,最終獲得10個(gè)變量(9種生物標(biāo)志物),脫氧皮質(zhì)醇、Cervonoyl ethanolamide、17 α-羥基妊娠烯醇酮、16α-羥基妊娠烯醇酮、1H-吲哚-3-基乙�；�-肌-肌醇、7-酮脫氧膽酸、去羥肌苷、3-氨基水楊酸、鄰苯三酚-2-O-葡萄糖醛酸鹽,作為評(píng)價(jià)芪葛顆粒對(duì)肝損傷模型的干預(yù)作用,發(fā)現(xiàn)芪葛顆粒對(duì)其中6種生物標(biāo)志物,鄰苯三酚-2-O-葡萄糖醛酸鹽、脫氧皮質(zhì)醇、17 α-羥基妊娠烯醇酮、16 α-羥基妊娠烯醇酮、1H-indol-3-ylacetyl-myo-inositol、去羥肌苷具有調(diào)節(jié)恢復(fù)作用,其中4種生物標(biāo)志物脫氧皮質(zhì)醇、17 α-羥基妊娠烯醇酮、16 α-羥基妊娠烯醇酮、1H-吲哚-3-基乙�；�-肌-肌醇具有顯著調(diào)節(jié)作用(P0.05)。芪葛顆粒干預(yù)肝損傷模型組大鼠藥效作用的關(guān)鍵通路主要為類(lèi)固醇激素的生物合成通路。結(jié)論:1.在乙醇誘導(dǎo)的酒精性肝損傷中,大鼠肝臟組織發(fā)生了脂肪變性,肝細(xì)胞索排列紊亂,肝竇少許淤血和出血,細(xì)胞腫脹明顯。血清檢測(cè)AST、ALT和TG及肝指數(shù)顯著明顯升高,表明造模成功。2.芪葛顆粒可以減輕乙醇導(dǎo)致的肝臟腫大,肝細(xì)胞組織的損傷程度,其可以降低血清AST、ALT和TG含量的升高。實(shí)驗(yàn)表明芪葛顆粒藥物具有保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的大鼠酒精性肝損傷的作用。3芪葛顆粒對(duì)酒精性肝損傷具有調(diào)節(jié)作用。芪葛顆粒通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠肝臟、血清、尿液的潛在生物標(biāo)志物,其作用機(jī)制與亞油酸代謝、甘油磷脂代謝、色氨酸代謝、花生四烯酸代謝、類(lèi)固醇激素的生物合成代謝等通路有關(guān)。將代謝通路進(jìn)行歸類(lèi)分析,從肝臟及血清中共同存在的代謝通路為甘油磷脂代謝和不飽和脂肪酸的生物合成代謝通路。從血清及尿液中共同存在的代謝通路為類(lèi)固醇激素生物合成代謝通路。表示酒精性肝損傷大鼠體內(nèi)脂代謝以及膽汁酸代謝作用失衡。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R285.5
【部分圖文】：

圖１．肝臟??

肝細(xì)胞骨架損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞氣球樣變和Ｍａｌｌ水樣變性較常見(jiàn)，肝細(xì)胞腫大，胞漿疏松淡損傷時(shí)，肝纖維化的主要形式包括：竇周纖區(qū)周?chē)w維化。Ｋｕｐｆｆｅｒ細(xì)胞明顯活化，生成狀細(xì)胞增生，使之合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，加較明顯，出現(xiàn)較特征性的竇周纖維化、終末靜炎癥．？活性氧的直接作用或腫瘤壞死因子（ＴＮＦ凋亡，形成單個(gè)散在凋亡小體，ＡＬＤ常見(jiàn)的小潤(rùn)，壞死灶可融合或形成橋接壞死［１２］。??損傷的研宄進(jìn)展??一種最常見(jiàn)的一元醇。在常溫常壓下是一種純液體不可直接飲用；具有特殊香味，并略

輔酶ＩＮＡＤＨ）；然后，在肝細(xì)胞線粒體內(nèi)由乙酸脫氫酶（ａｌｄｅｈｙｄｅ?ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；??ＡＬＤ１）氧化為乙酸；同時(shí)ＮＡＤ轉(zhuǎn)化為ＮＡＤＨ；最后，乙酸由肝釋放入血液，在外周組織??氧化成二氧化碳和水（見(jiàn)圖３），此外，少量乙醇由尿（低于１％）和通過(guò)肺（１％－３％）??排至體外。??Ｅｔｕｎｏｌ??ＮＡＤ．＇?，?ＣＨａＣＨｊＯＨ?＇?，??￣￣?ｊ??７７Ａ??ＮＡＯＨ?Ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ?ＮＡＤＰＨ??／?ＣＨｊＣＨＯ??４?｜???，??Ａｌｄｏｈｙｄｅ??ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ??ＡｃｅＵｔｅ?＼??ＣＫ／ＸＸＴ?Ｄｉｓｕｉｌｉｒａｉｎ??圖３乙醇的代謝??Ｆｉｇ．?３?Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ?ｏｆ?Ｅｔｈａｎｏｌ??注：圖片引用１＾口５：／／＾＼＼＾．３６０乙１１＞＾．。０１１］／１１０１１１６－『６５６＆１＊（：１１－１１１（１６乂－１＾〇１－７７．５［１１：１１１１??（二）乙醇的代謝??乙醇的主要代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟的毒性作用更大，主要表現(xiàn)在：（１）降低肝臟對(duì)脂肪酸??的氧化；（２）損傷線粒體、抑制三羧酸循環(huán)；（３）影響肝臟的微管系統(tǒng)，使微粒蛋白??分泌減少，造成脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在肝臟細(xì)胞中沉積；（４）與細(xì)胞膜結(jié)合，改變其通透性及??流動(dòng)性，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷；（５）抑制ＤＮＡ的修復(fù)和中胞嘧啶的甲基化，從而抑制??細(xì)胞的分化及損傷組織的再生、修復(fù)；（６）乙醛能增加膠原的合成及的合成，促進(jìn)肝??纖維化的形成。另一方面
【參考文獻(xiàn)】

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