目的觀察左歸丸對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)模型大鼠脛骨和下丘腦中β2腎上腺素受體(β2-adrenergic receptor,β2-AR)mRNA及蛋白水平的表達(dá),探討PMOP的可能發(fā)病機(jī)制和左歸丸的藥效及可能的作用機(jī)制,為左歸丸治療PMOP的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)參考。方法50雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組10只和造模組40組,去勢(shì)法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型。根據(jù)造模情況,將剩余36只造模組大鼠隨機(jī)分為模型組,雌二醇組,左歸丸低劑量組和左歸丸高劑量組,每組9只。灌胃給藥12周后,通過(guò)顯微CT(μ-CT)檢測(cè)股骨骨密度和松質(zhì)骨三維形態(tài)結(jié)構(gòu)及骨參數(shù)(骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction,BV/TV),骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th),骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N),骨小梁間隙(trabecular Separation,Tb.Sp));蘇木精-伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色法觀察大鼠骨組織形態(tài)學(xué)變化;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)大鼠血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BALP),1型膠原羧基端肽交聯(lián)((βcross-linked C-telopeptide of type 1 collagen,β-CTX),抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tarte-resistant acid phosphatase,TRAP-5b)的含量;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)大鼠脛骨及下丘腦β2-AR,骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG),核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NK-κB ligand,RANKL)mRNA 表達(dá)水平;蛋白印跡試驗(yàn)(Western blot,WB)檢測(cè)大鼠脛骨及下丘腦β2-AR,脛骨OPG,RANKL蛋白表達(dá)水平。結(jié)果(1)骨密度:與假手術(shù)組相比,模型組大鼠股骨骨密度顯著降低(P0.01);與模型組相比,左歸丸高低劑量組和雌二醇組大鼠股骨骨密度顯著升高(P0.05;P0.01),但三組間差距不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)骨組織形態(tài)學(xué):μ-CT三維圖像示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠骨小梁明顯稀疏,數(shù)目減少,變細(xì),斷裂,間距加寬,骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較大的空白區(qū)域。與模型組相比,左歸丸高低劑量組和雌二醇組骨小梁變密,連續(xù)性增加,空隙率下降,微觀結(jié)構(gòu)明顯改善。HE染色示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠骨小梁明顯稀少,變細(xì),結(jié)構(gòu)不完整,排列疏松,存在大量空骨陷窩,小梁間距變寬。與模型組相比,左歸丸高低劑量組和雌二醇組骨小梁數(shù)量明顯增多,分布均勻,結(jié)構(gòu)較完整,排列尚可,小梁空骨陷窩減少,間距變窄。(3)松質(zhì)骨參數(shù):與假手術(shù)組相比,模型組大鼠BV/TV,Tb.Th和Tb.N均明顯降低(P0.01)而Tb.Sp明顯升高(P0.01);與模型組比較,左歸丸高低劑量組和雌二醇組BV/TV,Tb.Th,Tb.N均顯著升高(P0.01)而Tb.Sp顯著降低(P0.01);與雌二醇組相比,左歸丸高低劑量組以上各項(xiàng)指標(biāo)差距不大,沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)血清骨代謝指標(biāo):與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清BALP明顯降低(P0.01)而β-CTX,TRAP-5b明顯升高(P0.01);與模型組相比,左歸丸高低劑量組和雌二醇組大鼠血清BALP顯著升高(P0.01)而β-CTX,TRAP-5b顯著降低(P0.01);與雌二醇組比較,左歸丸低劑量組血清TRAP-5b升高(P0.05),余無(wú)明顯差別(P0.05)。(5)mRNA表達(dá):與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脛骨及下丘腦OPG mRNA表達(dá)水平顯著降低(P0.01;P0.05)而β2-AR,RANKL mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P0.01;P0.05);與模型組相比,左歸丸高低劑量組和雌二醇組大鼠脛骨及下丘腦OPG mRNA表達(dá)水平升高(P0.05;P0.01)而β2-AR,RANKL mRNA表達(dá)水平均有不同程度降低(P0.01;P0.05);與雌二醇組相比,左歸丸高低劑量組大鼠下丘腦β2-AR mRNA表達(dá)水平升高(P0.05),余差異不顯(P0.05)。(6)蛋白表達(dá):與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脛骨及下丘腦β2-AR蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.01),脛骨RANKL蛋白表達(dá)水平也顯著升高(P0.01)而脛骨OPG蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.01);與模型組相比,左歸丸高低劑量組和雌二醇組大鼠脛骨及下丘腦β2-AR蛋白表達(dá)水平均不同程度降低(P0.05;P0.01),脛骨RANKL蛋白表達(dá)水平也顯著降低(P0.01)而脛骨OPG蛋白表達(dá)水平升高(P0.01;P0.05);與雌二醇組相比,左歸丸高低劑量組以上各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯差異,沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論(1)PMOP的形成與交感神經(jīng)興奮性提高,激活骨組織及下丘腦中的β2-AR,進(jìn)而影響OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)存在相關(guān)性。(2)左歸丸可通過(guò)抑制骨吸收,促進(jìn)骨形成,從而逆轉(zhuǎn)PMOP高轉(zhuǎn)換型骨狀態(tài),提高骨質(zhì)量,延緩骨量流失。(3)左歸丸通過(guò)降低骨組織和下丘腦中的β2-AR水平,抑制交感神經(jīng)的興奮性,從而影響OPG/RANKL/RANK系統(tǒng),進(jìn)而影響骨重建可能是其治療PMOP的機(jī)制之一。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R285.5
【部分圖文】：

＾?０?２?４?６?８?１０?１２?１４?１６?１８?２０??時(shí)間（周）??圖１對(duì)去卵巢大鼠體重的影響Ｇ±ｓ，ｎ＝８）??Ｆｉｇ．?１?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｎ?ｗｅｉｇｈｔ?ｏｆ?ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ?ｒａｔｓ?（；?士５，１１＝８）??術(shù)組，ＯＶＸ：模型組，Ｅ２：雌二醇組，ＺＧＷ－Ｌ：左歸丸低劑量組，ＺＧＷ－Ｈ：左歸．０１；與模型組相比＾＾＜０．０１，＃Ｐ＜０．０５。??

?４．３．４對(duì)去卵巢大鼠股骨組織病理形態(tài)的影響??結(jié)果如圖３所示。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠左股骨遠(yuǎn)端骨小梁明顯稀少，變??細(xì)，結(jié)構(gòu)不完整，排列疏松，存在大量空骨陷窩，小梁間距變寬。經(jīng)左歸丸高低劑量或??雌二醇治療３個(gè)月后，骨小梁與模型組相比數(shù)量明顯增多，分布均勻，結(jié)構(gòu)較完整，排??列尚可，小梁空骨陷窩減少，間距變窄，整體形態(tài)結(jié)構(gòu)較模型組有所改善。??ＢＩＨＩＭ??Ｓｈａｍ?ＯＶＸ?Ｅ２??＾：；；；：．?Ｉ：；：；：??ＺＧＷ－Ｌ?ＺＧＷ－Ｈ??圖３對(duì)去卵巢大鼠股骨組織病理形態(tài)的影響（ＨＥ，１０〇ｘ）??Ｆｉｇ．３?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｎ?ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ｆｅｍｕｒ?ｉｎ?ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ?ｒａｔｓ?（ＨＥ，１０〇ｘ）??注：Ｓｈａｍ：假手術(shù)組，ＯＶＸ：模型組，Ｅ２：雌二醇組，ＺＧＷ－Ｌ：左歸丸低劑量組，ＺＧＷ－Ｈ：左歸丸高劑量組。??Ｎｏｔｅｓ：?Ｓｈａｍ：?ｓｈａｍ－ｏｐｅｒａｔｅｄ?ｇｒｏｕｐ，?ＯＶＸ：?ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ?ｍｏｄｅｌ?ｇｒｏｕｐ．?Ｅ２：ｌ?７｜３－ｅｓｔｒａｄｉｏｌ?ｔｒｅａｔｅｄ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｇｒｏｕｐ，?ＺＧＷ－Ｌ：Ｌｏｗ??ｄｏｓｅ?ｇｒｏｕｐ?ｏｆ?Ｚｕｏｇｕｉｗａｎ
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