目的:因TLR8是參與抗病毒天然免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要受體之一,而關(guān)于中藥對TLR8調(diào)節(jié)作用機(jī)制方面的探索研究甚少。故本課題選擇已報(bào)道的抗炎抗病毒中藥單體:黃芩苷、青藤堿、吉馬酮、白花丹醌、沒食子酸進(jìn)行篩選研究。本課題主要目標(biāo)是初步探討黃芩苷、青藤堿等中藥單體是否能通過調(diào)節(jié)TLR8發(fā)揮免疫作用,將為研究抗炎抗病毒中藥的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:(1)采用密度梯度離心法分離正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),并以黃芩苷、青藤堿、吉馬酮、白花丹醌、沒食子酸、R848(TLR7/8刺激劑)分別刺激PBMCs12h和24h,以RT-PCR方法檢測TLR8mRNA表達(dá),從中篩選出對TLR8有調(diào)節(jié)作用的中藥單體。(2)通過CCK-8法測定THP-1細(xì)胞活力,探討篩選的黃芩苷、青藤堿、吉馬酮對其活力的影響,篩選最佳的濃度范圍。(3)熒光定量PCR檢測黃芩苷、青藤堿、吉馬酮對THP-1細(xì)胞和人PBMCs TLR8mRNA表達(dá)的差異。ELISA法檢測TLR8下游細(xì)胞因子ELISA法檢測THP-1細(xì)胞TLR8下游細(xì)胞因子IL-12、IL-6的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)黃芩苷作用12h(P0.05)、吉馬酮作用24h(P0.001)對人PBMCs TLR8mRNA表達(dá)有上調(diào)作用;青藤堿能顯著降低R848刺激人PBMCs后的TLR8 mRNA的上調(diào)表達(dá)。白花丹醌、沒食子酸無顯著作用(P0.05)。從中篩選出黃芩苷、青藤堿、吉馬酮這三種對正常人PBMCsTLR8有調(diào)節(jié)作用的中藥單體。(2)CCK8法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,青藤堿、黃芩苷藥物濃度為400μmol/L及吉馬酮藥物濃度維持在200μmol/L以下時(shí)對THP-1細(xì)胞的活性影響較小。(3)黃芩苷對THP-1細(xì)胞、人PBMCs后的TLR8表達(dá)有上調(diào)作用(P0.05),高劑量時(shí)對IL-12、IL-6有下調(diào)作用(P0.05);吉馬酮對THP-1細(xì)胞、人PBMCs后的TLR8、IL-12表達(dá)有上調(diào)作用(P0.01),高劑量時(shí)對IL-6有下調(diào)作用(P0.05);青藤堿能顯著降低R848刺激THP-1細(xì)胞和人PBMCs后的TLR8、IL-12、IL-6的上調(diào)表達(dá)(P0.01)。結(jié)論:青藤堿、黃芩苷、吉馬酮對THP-1細(xì)胞、人PBMCs TLR8有調(diào)節(jié)作用。青藤堿能顯著降低R848刺激THP-1細(xì)胞、人PBMCs后的TLR8上調(diào)表達(dá);黃芩苷、吉馬酮對THP-1細(xì)胞、人PBMCs后的TLR8表達(dá)有上調(diào)作用,但其同時(shí)也影響其他受體如TLR4,TLR4和TLR8共同下游因子IL-6、IL-12等表達(dá)降低,說明黃芩苷可能是通過其他途徑影響TLR8來參與對人天然免疫能力的調(diào)節(jié)。吉馬酮通過上調(diào)THP-1細(xì)胞的TLR8表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)IL-12的分泌及抑制IL-6的分泌,說明吉馬酮的抗炎作用可能與其對TLR8表達(dá)影響的關(guān)系較小。
【學(xué)位單位】：廣西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1 R848、黃芩苷、白花丹醌、沒食子酸、青藤堿、吉馬酮對正常人 PBMCsTLR8mRNA 表達(dá)的影響。A、B：12h TLR8 mRNA 表達(dá)量，從左至右分別是黃芩苷、青藤堿+R848、吉馬酮、空白組、吉馬酮+R848、沒食子酸+R848、R848、白花丹醌+R848；C、D：12h TLR8 mRNA 表達(dá)量，從左至右分別是沒食子酸、白花丹醌、青藤堿；E、F：24h TLR8 mRNA 表達(dá)量，從左至右分別是黃芩苷、空白、吉馬酮+R848、R848、青藤堿+R848、沒食子酸+R848、白花丹醌+R848、吉馬酮；G、H：24h TLR8 mRNA 表達(dá)量，從左至右分別是白花丹醌、青藤堿、沒食子酸（ x ±s,n=3）。

圖 2 藥物直接干預(yù)組 12h、24h 正常人 PBMCsTLR8 mRNA 相對表達(dá)量。A：藥物直接干預(yù)組 12hTLR8 mRNA 相對表達(dá)量；B：藥物直接干預(yù)組 24h TLR8 mRNA 相對表達(dá)量；（ x ±s,n=3）。與空白組比，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001C D

21圖 3 R848+藥物干預(yù)組 12h、24h 正常人 PBMCsTLR8 mRNA 相對表達(dá)量。C：R848+藥物干預(yù)組12h TLR8 mRNA 相對表達(dá)量；D：R848+藥物干預(yù)組 24h TLR8 mRNA 相對表達(dá)量。（ x ±s,n=3）。與空白組比，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001；與陽性組比，#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2837502