類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以滑膜炎和軟骨破壞為主要病理特征的系統(tǒng)性的自身免疫疾病。RA發(fā)病機制尚不明確,但已有大量的研究表明,巨噬細胞參與了RA的發(fā)生和發(fā)展。RA患者滑膜中大量浸潤的巨噬細胞,被視為是RA的早期標(biāo)志,且與疾病活動度相關(guān)。根據(jù)表型和功能,巨噬細胞主要分為M1型促炎型巨噬細胞和M2型抗炎型巨噬細胞。正常生理狀態(tài)下,巨噬細胞的表型處于動態(tài)平衡。但是在RA患者以及關(guān)節(jié)炎動物模型中,多種因素會打破這種平衡,引起M1/M2型巨噬細胞數(shù)量和比例的失衡,導(dǎo)致M1型巨噬細胞不斷增多,從而加劇炎癥反應(yīng)。然而,目前臨床上并沒有特定針對巨噬細胞的藥物。文獻報道,前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)能夠通過c AMP-CREB/CRTC通路,激活Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor4,KLF4)轉(zhuǎn)錄因子,促進M2型巨噬細胞極化。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),PGE2水平在佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis,AA)大鼠血清中升高,在AA滑膜細胞中,PGE2不斷刺激下,G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)轉(zhuǎn)膜增加,EP4受體過度脫敏,環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)水平降低。GRK2是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)的負性調(diào)節(jié)劑,可特異性地活化GPCRs,使其磷酸化,從而介導(dǎo)受體脫敏,但PGE2介導(dǎo)的巨噬細胞上的EP受體過度脫敏,尤其是EP4受體的過度脫敏尚未見報道。RA患者以及關(guān)節(jié)炎動物模型中,M1/M2型巨噬細胞的比例失衡是否與巨噬細胞中EP受體的過度脫敏有關(guān),也尚未見報道。芍藥苷-6-氧-苯磺酸酯(CP-25),是我們所研發(fā)的一種具有抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的新型活性化合物,能夠改善AA大鼠/膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-inducedarthritis,CIA)小鼠模型臨床表現(xiàn),調(diào)節(jié)巨噬細胞細胞因子平衡。前期研究發(fā)現(xiàn),CP-25能夠通過抑制AA大鼠滑膜細胞中的GRK2轉(zhuǎn)膜,恢復(fù)EP4的膜表達,升高c AMP水平,從而抑制AA大鼠滑膜細胞的異常增殖。但CP-25對巨噬細胞M1/M2比例的失衡是否具有作用,作用機制如何,尚不清楚。目的:觀察PGE2及其信號對CIA小鼠巨噬細胞和Raw264.7細胞極化的影響及CP-25對巨噬細胞極化的作用和作用機制,為揭示PGE2及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與RA中巨噬細胞M1/M2比例失衡以及GRK2作為CP-25的作用靶點調(diào)控巨噬細胞極化提供實驗依據(jù)。方法:用雞Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑制備CIA小鼠炎癥模型,原代培養(yǎng)CIA小鼠腹腔巨噬細胞(Peritoneal macrophage,PM)和骨髓源巨噬細胞(bone marrow derived macrophage,BMM);用Western blot法檢測巨噬細胞中i NOS,Arg1,p-CREB,CREB水平以及EP4和GRK2的膜表達;QRT-PCR法檢測巨噬細胞IRF4,IRF5,Mincle,YM-1,IL-10,TNF-α和EP m RNA各亞型的表達;流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞表型CD86,CD206和F4/80的表達,巨噬細胞表面EP4和GRK2的表達以及巨噬細胞吞噬作用;ELISA法檢測PGE2和c AMP的水平;CP-25(35 mg/kg)灌胃給藥,依那西普(4.5mg/kg)腹腔注射,進行多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分;激光共聚焦顯微觀察法檢測EP4和GRK2在巨噬細胞上的分布;免疫共沉淀法檢測巨噬細胞上EP4和GRK2的相互作用;高內(nèi)涵成像儀觀察巨噬細胞中EP4和GRK2的表達;si RNA瞬時沉默Raw264.7中GRK2基因表達;CRISPR/Cas 9敲除Raw264.7中GRK2基因表達;用CRISPR/Cas 9技術(shù)構(gòu)建GRK2 KO小鼠,取GRK2 KO小鼠PM和BMM;結(jié)果:1.CIA小鼠巨噬細胞中M1/M2的比例變化選取CIA小鼠PM,結(jié)果顯示,與正常組對比,模型組中巨噬細胞M1標(biāo)記i NOS水平上升,M2標(biāo)記Arg1水平降低;CD86/CD206的比例升高;巨噬細胞吞噬作用增強。IRF5,Mincle和TNF-α的m RNA水平升高,RF4,YM1和IL-10的m RNA水平降低。我們還檢測了CIA小鼠BMM中i NOS和Arg1的水平,結(jié)果顯示,與正常組對比,模型組中巨噬細胞i NOS水平上升,Arg1水平降低。2.PGE2及其信號對CIA小鼠巨噬細胞極化的影響為了探究PGE2-EP-c AMP-CREB在巨噬細胞極化中的作用,我們檢測了PGE2及其信號的表達。與正常組對比,模型組中血清和PM上清中PGE2水平升高,EP4受體膜表達降低,GRK2膜表達升高,c AMP和p-CREB水平降低。c AMP類似物dbc AMP能夠降低正常組和模型組小鼠PM中M1/M2的比例,PGE2(1μM)能夠降低正常組小鼠PM的M1/M2比例,對模型組小鼠PM極化無顯著性作用。提示PGE2對正常組和模型組小鼠PM極化作用的不同,可能與PGE2的濃度、EP受體敏感性和細胞極化狀態(tài)等有關(guān)。那么PGE2的四個EP受體是哪個發(fā)揮作用的呢?結(jié)果顯示,EP2和EP4受體的總表達升高,EP4受體的m RNA水平升高。提示EP2和EP4受體可能參與小鼠CIA的發(fā)病進程。為進一步明確PGE2是通過哪個受體調(diào)控c AMP-CREB,我們用EP2受體激動劑和EP4受體激動劑同樣條件下刺激正常組和模型組PM,EP4受體激動劑與PGE2(1μM)有相似的結(jié)果,提示PGE2可能通過EP4受體調(diào)控c AMP-CREB。PGE2刺激下正常組小鼠PM中EP4受體膜表達升高,GRK2膜表達升高,模型組小鼠PM中EP4受體膜表達無顯著性變化,GRK2膜表達升高。提示EP4的過度脫敏,GRK2轉(zhuǎn)膜增加,可能與PGE2對模型組小鼠PM極化作用失調(diào)有關(guān)。利用激光共聚焦,發(fā)現(xiàn)PM中的EP4受體和GRK2主要分布在胞膜和胞質(zhì)中,Merge圖提示PM中的EP4受體和GRK2存在相互作用;我們進一步通過免疫共沉淀法,發(fā)現(xiàn)在正常組中,GRK2和EP4受體間存在相互作用,模型組中GRK2和EP4受體的相互作用增強。3.PGE2及其信號對Raw264.7細胞極化的影響體外刺激誘導(dǎo)M1和M2型巨噬細胞。與M0組對比,M1組中EP4受體膜表達降低,GRK2膜表達升高,c AMP和p-CREB水平降低。M2組中EP4受體膜表達升高,GRK2膜表達降低,c AMP和p-CREB水平升高。c AMP類似物dbc AMP能夠降低M0,M1和M2型巨噬細胞中M1/M2的比例。PGE2刺激M0組中,PGE2(100n M,1μM)組CD86/CD206降低,EP4膜表達升高,c AMP水平升高;PGE2刺激M1組中,PGE2(1μM,10μM)組CD86/CD206升高,EP4膜表達降低,c AMP水平降低;PGE2刺激M2組中,PGE2(10n M,100n M,1μM,10μM)組CD86/CD206降低,EP4膜表達升高,c AMP水平升高。激光共聚焦顯微鏡觀察M0,M1和M2型巨噬細胞,發(fā)現(xiàn)EP4和GRK2主要分布在胞漿和胞膜,Merge圖提示EP4和GRK2存在一定的相互作用;免疫共沉淀法顯示,與M0組對比,M1組中GRK2-EP4的相互作用增強,M2組中GRK2-EP4的相互作用無顯著性變化。4.GRK2對巨噬細胞極化的影響及對EP4過度脫敏的作用為進一步探討GRK2對巨噬細胞上EP4受體過度脫敏的影響及GRK2對巨噬細胞極化的影響,用si RNA沉默GRK2基因表達后,發(fā)現(xiàn)GRK2 si RNA干擾后的Raw264.7細胞M1/M2比例降低。用CRIPR/Cas9敲除GRK2基因后,發(fā)現(xiàn)Raw264.7-GRK2-/-細胞中CD86/CD206比例降低。用PGE2(10μM)不同時間點刺激Raw264.7細胞,結(jié)果顯示,Raw264.7中CD86/CD206逐漸降低,20 min達到最低值,1h后與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。用PGE2(10μM)不同時間點刺激GRK2 si RNA沉默的Raw264.7細胞,GRK2 si RNA沉默的Raw264.7細胞中CD86/CD206逐漸降低,30 min達到最低值,2h后與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PGE2(10μM)刺激下,Raw264.7-GRK2-/-細胞中CD86/CD206逐漸降低,2h達到最低值,12h時無顯著性差異。隨著PGE2(10μM)刺激時間的延長,EP4受體的膜表達逐漸升高,2h處達到最高值,之后下降,12h的EP4受體膜表達與對照組無顯著性差異。5.CP-25通過抑制GRK2膜轉(zhuǎn)位恢復(fù)PGE2-EP4-c AMP-CREB正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控巨噬細胞極化治療小鼠CIACP-25(35mg/kg)可明顯降低CIA小鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分,表明CP-25對CIA小鼠具有治療作用。CP-25(35mg/kg)可不同程度降低血清和PM上清中PGE2的水平,降低CIA小鼠PM和BMM中i NOS水平,升高Arg1水平;使CD86/CD206的比例升高;巨噬細胞吞噬作用減弱。IRF5,Mincle和TNF-α的m RNA水平降低,RF4,YM1和IL-10的m RNA水平升高。CP-25(35mg/kg)能夠升高EP4受體的膜表達,降低GRK2的膜表達,減弱EP4-GRK2間的相互作用。結(jié)論:1.CIA小鼠巨噬細胞中M1/M2比例升高,CP-25(35mg/kg)能夠降低M1/M2的比例,恢復(fù)M1和M2的平衡。2.CIA小鼠血清和PM上清中PGE2水平升高,PGE2不斷刺激下,PM中EP4受體過度脫敏,c AMP水平和p-CREB表達減少。PGE2-EP4-c AMP-CREB信號通路介導(dǎo)了CIA小鼠巨噬細胞向M1型極化。3.CIA小鼠巨噬細胞的GRK2異常升高,與EP4受體共表達,GRK2介導(dǎo)EP4受體過度脫敏參與CIA小鼠巨噬細胞PGE2-EP4-c AMP-CREB信號異常導(dǎo)致M1型巨噬細胞極化。4.CP-25抑制GRK2膜轉(zhuǎn)位,恢復(fù)EP4受體的敏感性,增加c AMP水平和p-CREB表達,從而促進M2型巨噬細胞極化,調(diào)控巨噬細胞M1/M2的比例平衡。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：
圖 1 Lenti-Cas9-puro 病毒載體Figure 1 Lenti-Cas9-puro virus vector，計數(shù)稀釋至細胞懸液濃度為 1×的細胞懸液，每孔細胞初始數(shù)為 過程中細胞是否生長正常）sG A 組G P 組緩慢融化。用無血清培養(yǎng)基將慢
GV391病毒載體
3.22.4 sgRNA 表達載體構(gòu)建測序峰圖Adrbk1-sgRNA(05986-1)-baaac TCGGAGGTTCTGACAAATCT cAdrbk1-sgRNA(05987-1)-aCACCg AGTCAAAGATCTCTCGGCTGAdrbk1-sgRNA(05987-1)-baaac CAGCCGAGAGATCTTTGACT c
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2836454
