異甘草酸鎂為第四代甘草酸衍生物,現(xiàn)今廣泛用于臨床治療慢性病毒性肝炎和化療藥物所致肝病。作為保肝藥,異甘草酸鎂已呈現(xiàn)好的應(yīng)用前景,而其產(chǎn)生的藥物相互作用仍需探究。因此,本實驗從藥物的外排和代謝這兩條最基礎(chǔ)的途徑入手,研究異甘草酸鎂在體內(nèi)外對P-gp和CYP3A影響及其產(chǎn)生影響的調(diào)控通路,旨在為其臨床合用藥物提供科學(xué)依據(jù)。目的:本課題先通過大鼠急性肝損傷實驗,確定異甘草酸鎂對急性肝損傷大鼠體內(nèi)P-gp和CYP3A1表達(dá)的影響,接著以人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞為對象研究異甘草酸鎂對HepG2細(xì)胞內(nèi)P-gp和CYP3A4活性及表達(dá)的影響。最后以HepG2細(xì)胞為研究對象研究異甘草酸鎂對核受體PXR mRNA水平和蛋白表達(dá)水平的影響,初步探討異甘草酸鎂對P-gp和CYP3A4的作用是否通過PXR調(diào)控。方法:在體內(nèi)實驗中,使用CCl_4造模急性肝損傷模型,建模成功后隨機分為三組:正常組,CCl_4急性肝損傷造模模型組,造模給藥異甘草酸鎂組。對各組進(jìn)行體內(nèi)給藥后,取出相應(yīng)的樣本進(jìn)行后續(xù)實驗,全自動生化儀檢測血清學(xué)指標(biāo),HE染色檢測各組大鼠肝組織病理狀態(tài)。RT-PCR和Western blot法對各組大鼠肝組織中P-gp及CYP3A1的m RNA和蛋白表達(dá)量進(jìn)行測定。體外實驗中,MTT實驗確定異甘草酸鎂的細(xì)胞給藥濃度,然后采用Rho-123實驗檢測異甘草酸鎂對HepG2細(xì)胞功能的影響,以及采用細(xì)胞色素CYP3A4酶活測定試劑盒測定異甘草酸鎂對HepG2細(xì)胞中CYP3A4酶活性的影響。最后研究異甘草酸鎂對P-gp及CYP3A4影響的分子機制,RT-PCR和Western blot法檢測了P-gp、CYP3A4及核受體PXR mRNA及蛋白表達(dá)的影響實驗,分析考察CYP3A4,P-gp的表達(dá)與PXR表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果:(1)各種大鼠血清學(xué)指標(biāo)ALT、AST及HE染色實驗確定了CCl_4造模的成功及異甘草酸鎂對急性肝損傷模型的緩解作用。(2)RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測異甘草酸鎂對CCl_4造模急性肝損傷大鼠中P-gp及CYP3A1酶基因和蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,CCl_4造模組的P-gp基因和蛋白與正常組相比是上調(diào)的,給藥異甘草酸鎂后抑制了P-gp的基因和蛋白的表達(dá)。而CYP3A1酶的基因變化趨勢與之相反,給藥后誘導(dǎo)了CYP3A1酶的基因和蛋白的表達(dá)。(3)采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞的毒性實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)0-480μM的對HepG2細(xì)胞的生長抑制率≤20%,為HepG2細(xì)胞無毒濃度。經(jīng)過前期的預(yù)實驗以及文獻(xiàn)參考,故選取異甘草酸鎂的給藥濃度梯度為7.5μM,15μM,30μM。(4)Rho-123實驗檢測異甘草酸鎂對HepG2細(xì)胞中P-gp功能的影響,蓄積和外排實驗結(jié)果都表明了7.5μM,15μM,30μM的異甘草酸鎂均能抑制P-gp的功能。且隨著濃度增加,其抑制作用越強。(5)通過對HepG2細(xì)胞中CYP450亞酶CYP3A4酶活的檢測,結(jié)果揭示了7.5μM的異甘草酸鎂能抑制HepG2細(xì)胞中CYP3A4酶活性,而15μM,30μM的異甘草酸鎂則能顯著性的誘導(dǎo)CYP3A4酶的活性。(6)RT-PCR和Western blot實驗檢測高中低濃度的異甘草酸鎂對HepG2細(xì)胞中CYP3A、P-gp及其上游調(diào)控因子PXR基因和蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示7.5μM,15μM的異甘草酸鎂對CYP3A表達(dá)有抑制作用,30μM則表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)作用,而30μM的異甘草酸鎂卻抑制了P-gp基因和蛋白的表達(dá),對于其上游調(diào)控因子PXR的基因和蛋白表達(dá)的測定實驗中顯示15μM,30μM的異甘草酸鎂均能上調(diào)PXR的表達(dá)。結(jié)論:異甘草酸鎂可上調(diào)急性肝損傷大鼠及HepG2細(xì)胞中CYP3A基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,且異甘草酸鎂誘導(dǎo)了HepG2細(xì)胞中CYP3A4酶的活性,從而促進(jìn)了經(jīng)CYP3A4酶介導(dǎo)的藥物的代謝。另外高濃度的異甘草酸鎂對P-gp功能和表達(dá)均有顯著抑制作用,提示當(dāng)臨床合用異甘草酸鎂與P-gp底物時,可以提高該藥物的生物利用度。此外,對于其上游調(diào)控因子核受體PXR而言,中高濃度的異甘草酸鎂均能誘導(dǎo)其表達(dá)。本實驗的研究結(jié)果可能為異甘草酸鎂與其他藥物聯(lián)用提供一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

4臟組織病理伊紅 HE 染色可以發(fā)現(xiàn)，正常組肝臟形態(tài)正大而圓，核膜清晰，核仁明顯，無細(xì)胞變性型組中，肝細(xì)胞變性壞死，肝細(xì)胞腫脹較 CCl4造模成功；造模給藥異甘草酸鎂組仍少，肝小葉結(jié)構(gòu)排列略整齊（圖 1C），可up ALT (IU/L) AST (IU/L) Albmal 54.14 ± 15.24 147.36 ± 20.15 34.38l43686.50 ±658.34**5978.67 ±736.13**31.31+ CCl4787.50 ±127.99**#1868.33 ±267.54**#30.43

一部分 異甘草酸鎂對急性肝損傷大鼠體內(nèi)肝組織中 P-gp 及 CYP3A1 酶表達(dá)的影草酸鎂對急性肝損傷大鼠體內(nèi)P-gp和CYP3A1酶CR 結(jié)果表明，與空白組比較 CCl4造模組顯著誘導(dǎo)了 MDR1）,給藥 20 mg/kg MgIg 顯著下調(diào)了造模所誘導(dǎo)的 MDR1mR）。而在急性肝損傷大鼠體內(nèi) CYP3A1 mRNA 卻與之相反現(xiàn)造模急性肝損傷后可顯著抑制 CYP3A1mRNA 的表達(dá)（P顯著誘導(dǎo)其表達(dá)。

甘草酸鎂對急性肝損傷大鼠體內(nèi) MDR1 和 CYP3A1 酶蛋白表達(dá)的影響，與正常組相比：*與造模組相比：##P<0.01. The effects of MgIg on the protein expression of MDR1 and CYP3A1 in acute rats, **P<0.01 vs group;##P<0.01 compared with Model group論肝臟對藥物代謝和處置中有著十分重要的作用，大多數(shù)藥物和毒物經(jīng)生物轉(zhuǎn)化作用而排出體外[48]。急性肝損傷已經(jīng)成為臨床上發(fā)生的常草酸鎂注射液作為新一代的甘草酸制劑目前已用于臨床[49]，作為急性尤其是化療藥物導(dǎo)致的急性肝損傷患者應(yīng)用最多的一種保肝制劑，其護(hù)肝細(xì)胞膜及改善肝功能等作用，并且據(jù)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)異甘草酸鎂產(chǎn)物單 18α異構(gòu)體甘草次酸，具有更強的保肝抗炎及抗氧化等多種功肝細(xì)胞膜，減輕肝細(xì)胞炎癥和壞死，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和修復(fù)[50~51]。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2836066