異甘草酸鎂為第四代甘草酸衍生物,現(xiàn)今廣泛用于臨床治療慢性病毒性肝炎和化療藥物所致肝病。作為保肝藥,異甘草酸鎂已呈現(xiàn)好的應用前景,而其產(chǎn)生的藥物相互作用仍需探究。因此,本實驗從藥物的外排和代謝這兩條最基礎(chǔ)的途徑入手,研究異甘草酸鎂在體內(nèi)外對P-gp和CYP3A影響及其產(chǎn)生影響的調(diào)控通路,旨在為其臨床合用藥物提供科學依據(jù)。目的:本課題先通過大鼠急性肝損傷實驗,確定異甘草酸鎂對急性肝損傷大鼠體內(nèi)P-gp和CYP3A1表達的影響,接著以人肝癌細胞株HepG2細胞為對象研究異甘草酸鎂對HepG2細胞內(nèi)P-gp和CYP3A4活性及表達的影響。最后以HepG2細胞為研究對象研究異甘草酸鎂對核受體PXR mRNA水平和蛋白表達水平的影響,初步探討異甘草酸鎂對P-gp和CYP3A4的作用是否通過PXR調(diào)控。方法:在體內(nèi)實驗中,使用CCl_4造模急性肝損傷模型,建模成功后隨機分為三組:正常組,CCl_4急性肝損傷造模模型組,造模給藥異甘草酸鎂組。對各組進行體內(nèi)給藥后,取出相應的樣本進行后續(xù)實驗,全自動生化儀檢測血清學指標,HE染色檢測各組大鼠肝組織病理狀態(tài)。RT-PCR和Western blot法對各組大鼠肝組織中P-gp及CYP3A1的m RNA和蛋白表達量進行測定。體外實驗中,MTT實驗確定異甘草酸鎂的細胞給藥濃度,然后采用Rho-123實驗檢測異甘草酸鎂對HepG2細胞功能的影響,以及采用細胞色素CYP3A4酶活測定試劑盒測定異甘草酸鎂對HepG2細胞中CYP3A4酶活性的影響。最后研究異甘草酸鎂對P-gp及CYP3A4影響的分子機制,RT-PCR和Western blot法檢測了P-gp、CYP3A4及核受體PXR mRNA及蛋白表達的影響實驗,分析考察CYP3A4,P-gp的表達與PXR表達水平的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果:(1)各種大鼠血清學指標ALT、AST及HE染色實驗確定了CCl_4造模的成功及異甘草酸鎂對急性肝損傷模型的緩解作用。(2)RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測異甘草酸鎂對CCl_4造模急性肝損傷大鼠中P-gp及CYP3A1酶基因和蛋白表達的影響,結(jié)果顯示,CCl_4造模組的P-gp基因和蛋白與正常組相比是上調(diào)的,給藥異甘草酸鎂后抑制了P-gp的基因和蛋白的表達。而CYP3A1酶的基因變化趨勢與之相反,給藥后誘導了CYP3A1酶的基因和蛋白的表達。(3)采用MTT法進行細胞的毒性實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)0-480μM的對HepG2細胞的生長抑制率≤20%,為HepG2細胞無毒濃度。經(jīng)過前期的預實驗以及文獻參考,故選取異甘草酸鎂的給藥濃度梯度為7.5μM,15μM,30μM。(4)Rho-123實驗檢測異甘草酸鎂對HepG2細胞中P-gp功能的影響,蓄積和外排實驗結(jié)果都表明了7.5μM,15μM,30μM的異甘草酸鎂均能抑制P-gp的功能。且隨著濃度增加,其抑制作用越強。(5)通過對HepG2細胞中CYP450亞酶CYP3A4酶活的檢測,結(jié)果揭示了7.5μM的異甘草酸鎂能抑制HepG2細胞中CYP3A4酶活性,而15μM,30μM的異甘草酸鎂則能顯著性的誘導CYP3A4酶的活性。(6)RT-PCR和Western blot實驗檢測高中低濃度的異甘草酸鎂對HepG2細胞中CYP3A、P-gp及其上游調(diào)控因子PXR基因和蛋白表達的影響,結(jié)果顯示7.5μM,15μM的異甘草酸鎂對CYP3A表達有抑制作用,30μM則表現(xiàn)出顯著的誘導作用,而30μM的異甘草酸鎂卻抑制了P-gp基因和蛋白的表達,對于其上游調(diào)控因子PXR的基因和蛋白表達的測定實驗中顯示15μM,30μM的異甘草酸鎂均能上調(diào)PXR的表達。結(jié)論:異甘草酸鎂可上調(diào)急性肝損傷大鼠及HepG2細胞中CYP3A基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,且異甘草酸鎂誘導了HepG2細胞中CYP3A4酶的活性,從而促進了經(jīng)CYP3A4酶介導的藥物的代謝。另外高濃度的異甘草酸鎂對P-gp功能和表達均有顯著抑制作用,提示當臨床合用異甘草酸鎂與P-gp底物時,可以提高該藥物的生物利用度。此外,對于其上游調(diào)控因子核受體PXR而言,中高濃度的異甘草酸鎂均能誘導其表達。本實驗的研究結(jié)果可能為異甘草酸鎂與其他藥物聯(lián)用提供一定的理論基礎(chǔ)。
【學位單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

4臟組織病理伊紅 HE 染色可以發(fā)現(xiàn)，正常組肝臟形態(tài)正大而圓，核膜清晰，核仁明顯，無細胞變性型組中，肝細胞變性壞死，肝細胞腫脹較 CCl4造模成功；造模給藥異甘草酸鎂組仍少，肝小葉結(jié)構(gòu)排列略整齊（圖 1C），可up ALT (IU/L) AST (IU/L) Albmal 54.14 ± 15.24 147.36 ± 20.15 34.38l43686.50 ±658.34**5978.67 ±736.13**31.31+ CCl4787.50 ±127.99**#1868.33 ±267.54**#30.43

一部分 異甘草酸鎂對急性肝損傷大鼠體內(nèi)肝組織中 P-gp 及 CYP3A1 酶表達的影草酸鎂對急性肝損傷大鼠體內(nèi)P-gp和CYP3A1酶CR 結(jié)果表明，與空白組比較 CCl4造模組顯著誘導了 MDR1）,給藥 20 mg/kg MgIg 顯著下調(diào)了造模所誘導的 MDR1mR）。而在急性肝損傷大鼠體內(nèi) CYP3A1 mRNA 卻與之相反現(xiàn)造模急性肝損傷后可顯著抑制 CYP3A1mRNA 的表達（P顯著誘導其表達。

甘草酸鎂對急性肝損傷大鼠體內(nèi) MDR1 和 CYP3A1 酶蛋白表達的影響，與正常組相比：*與造模組相比：##P<0.01. The effects of MgIg on the protein expression of MDR1 and CYP3A1 in acute rats, **P<0.01 vs group;##P<0.01 compared with Model group論肝臟對藥物代謝和處置中有著十分重要的作用，大多數(shù)藥物和毒物經(jīng)生物轉(zhuǎn)化作用而排出體外[48]。急性肝損傷已經(jīng)成為臨床上發(fā)生的常草酸鎂注射液作為新一代的甘草酸制劑目前已用于臨床[49]，作為急性尤其是化療藥物導致的急性肝損傷患者應用最多的一種保肝制劑，其護肝細胞膜及改善肝功能等作用，并且據(jù)文獻研究發(fā)現(xiàn)異甘草酸鎂產(chǎn)物單 18α異構(gòu)體甘草次酸，具有更強的保肝抗炎及抗氧化等多種功肝細胞膜，減輕肝細胞炎癥和壞死，促進肝細胞的再生和修復[50~51]。
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本文編號：2836066