一、研究目的侵襲性真菌感染(invasive fungal infections,IFIs)嚴(yán)重威脅免疫功能低下人群的健康,雖然醫(yī)療手段日益進(jìn)步,但是IFIs的致病率和致死率始終居高不下。引發(fā)IFIs的常見病原菌包括念珠菌屬、曲霉菌屬和隱球菌屬等,其中以白念珠菌感染最為多見。除了播散性的全身感染,在粘膜、器官以及各種生物材料表面形成生物被膜也是白念珠菌感染人體的常見方式,而生物被膜對(duì)目前臨床上絕大部分抗真菌藥物都高度耐藥,給臨床治療造成很大困難。目前臨床上對(duì)于IFIs的治療仍然存在很多問題,一方面,臨床用藥選擇有限,而且存在或肝腎毒性大或價(jià)格昂貴等問題;另一方面,隨著現(xiàn)有抗真菌藥物的長(zhǎng)期使用,真菌耐藥也逐漸成為影響臨床治療的重要問題。因此,尋找新型高效低毒的抗真菌化合物具有切實(shí)的意義。天然產(chǎn)物是藥物發(fā)現(xiàn)的資源寶庫(kù)。我們課題組前期在天然產(chǎn)物中篩選具有抗真菌活性的小分子化合物,發(fā)現(xiàn)血根堿(sanguinarine,SAN)具有強(qiáng)效的抗真菌作用,并且在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn),SAN對(duì)生物被膜也有良好的抑制效果,而且抗生物被膜起效濃度低于其最低抑菌濃度。本課題全面考察了SAN的抗真菌活性,并研究了其依賴于濃度的抗真菌作用機(jī)制。二、研究方法與結(jié)果我們首先通過微量液基稀釋法考察了SAN的抗真菌譜,發(fā)現(xiàn)其對(duì)臨床常見致病真菌白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新型隱球菌、煙曲霉菌以及紅色毛癬菌都有較好的抗菌活性,最低抑菌濃度為0.4-6.4 mg/L,其中對(duì)白念珠菌的最低抑菌濃度為3.2 mg/L;另外,一些對(duì)氟康唑(fluconazole,FLU)耐藥的真菌,SAN也表現(xiàn)出與對(duì)敏感菌類似的抗菌活性。為了進(jìn)一步明確SAN的抗菌作用,我們選取白念珠菌和新型隱球菌為代表,進(jìn)行瓊脂平皿紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)考察SAN的抑菌圈,并且繪制了SAN的殺菌曲線。結(jié)果顯示SAN對(duì)兩種菌都表現(xiàn)出劑量依賴的殺菌作用,3.2 mg/L SAN能夠?qū)Π啄钪榫a(chǎn)生顯著的殺菌作用。隨后我們進(jìn)行了抗真菌后效應(yīng)的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)SAN存在劑量依賴的抗真菌后效應(yīng)。我們用XTT法考察SAN的抗白念珠菌生物被膜作用,結(jié)果顯示SAN在低于最低抑菌濃度的條件下(0.4-1.6 mg/L)即產(chǎn)生抗生物被膜活性;而且SAN不僅能夠抑制初期生物被膜的形成,還能夠破壞已經(jīng)形成的成熟生物被膜,兩種情況均具有劑量依賴性。我們進(jìn)而利用小鼠白念珠菌感染模型考察了SAN的體內(nèi)抗真菌活性,結(jié)果表明SAN能劑量依賴地保護(hù)真菌感染小鼠,1 mg/kg SAN在體內(nèi)能夠顯著延長(zhǎng)感染小鼠的存活時(shí)間并提高小鼠存活率。我們還對(duì)SAN的安全性進(jìn)行了初步的考察,利用MTT法考察SAN對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響,結(jié)果顯示SAN對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性相對(duì)較低,IC_(50)值為7.8 mg/L,與對(duì)白念珠菌的最低抑菌濃度3.2 mg/L之間存在較大治療窗,說明SAN對(duì)真菌的抑制作用具有一定的特異性。在對(duì)SAN抗真菌機(jī)制的探究中,我們分別考察了SAN在低濃度下(≤1.6 mg/L)的抗生物被膜機(jī)制和高濃度下(≥3.2 mg/L)的殺浮游菌機(jī)制。首先是抗生物被膜機(jī)制:我們進(jìn)行細(xì)胞表面疏水性測(cè)定,考察SAN對(duì)白念珠菌粘附能力的影響,結(jié)果表明SAN能夠劑量依賴地降低白念珠菌的細(xì)胞表面疏水性;然后我們用幾種不同的菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基考察SAN對(duì)菌絲形成的影響,結(jié)果顯示SAN能夠劑量依賴地抑制不同培養(yǎng)基中菌絲的形成;隨后我們用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)考察SAN對(duì)菌絲和粘附相關(guān)基因表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)SAN能夠使cAMP通路相關(guān)基因ECE1、HWP1、HGC1、ALS3、CYR1的表達(dá)下調(diào),提示SAN的抗生物被膜作用與cAMP通路受抑制有關(guān);于是我們測(cè)定了SAN處理后白念珠菌細(xì)胞中cAMP的含量,發(fā)現(xiàn)cAMP含量顯著降低,并且外源加入cAMP后白念珠菌的菌絲形成能力得到了恢復(fù)。其次我們研究了SAN高濃度下的殺菌機(jī)制:我們利用基因芯片技術(shù)和iTRAQ技術(shù)考察高濃度SAN處理后白念珠菌的基因組轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)都出現(xiàn)明顯的上調(diào),提示細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了氧化應(yīng)激;于是我們用DCFH-DA熒光探針測(cè)定了細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)ROS水平顯著升高,而加入抗氧化劑后,SAN的殺菌作用明顯減弱,證明SAN的殺菌作用與ROS水平升高有關(guān);我們利用DAPI染料和TUNEL試劑觀察SAN處理后染色體的凝集現(xiàn)象和DNA鏈斷裂情況,說明SAN處理后細(xì)胞遺傳物質(zhì)受到了損傷,而加入抗氧化劑能使這種損傷減輕;最后我們用Annexin-V-FITC和PI染料考察SAN對(duì)白念珠菌凋亡和壞死的影響,結(jié)果顯示SAN能夠誘導(dǎo)白念珠菌發(fā)生凋亡,并且抗氧化劑的加入能夠顯著減輕SAN誘導(dǎo)凋亡的作用。三、研究結(jié)論SAN抗真菌譜廣、殺菌作用強(qiáng)、具有良好的抗生物被膜活性、體內(nèi)有效并且毒性較低,是較理想的抗真菌候選先導(dǎo)化合物。SAN在低濃度下(≤1.6 mg/L)通過抑制cAMP通路發(fā)揮抗生物被膜作用;而在高濃度下(≥3.2 mg/L)通過升高細(xì)胞內(nèi)ROS,導(dǎo)致DNA損傷并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生殺菌作用。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略詞表
前言
材料與方法
    一、實(shí)驗(yàn)材料
    二、實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    一、SAN的體外抗真菌作用
        (一)SAN的抗真菌譜
        (二)SAN的體外殺菌作用
        (三)SAN存在抗真菌后效應(yīng)
        (四)SAN的抗生物被膜作用
    二、SAN的體內(nèi)抗真菌活性
    三、SAN對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性較低
    四、SAN抗白念珠菌的機(jī)制
        (一)低濃度條件下SAN的抗生物被膜作用機(jī)制
        (二)高濃度條件下SAN的殺菌作用機(jī)制
實(shí)驗(yàn)討論
    一、SAN的抗真菌作用
    二、SAN的抗真菌機(jī)制
總結(jié)
附錄
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表論文和參加科研情況說明
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 胡丹丹;紫檀茋抗白念珠菌生物被膜的作用及自噬影響生物被膜的機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

2 劉遠(yuǎn)飛;氟喹諾酮類抗菌藥后效應(yīng)及其機(jī)制的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

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1 吳晶;中藥抗真菌的活性篩選及作用機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2835949