一、研究目的侵襲性真菌感染(invasive fungal infections,IFIs)嚴重威脅免疫功能低下人群的健康,雖然醫(yī)療手段日益進步,但是IFIs的致病率和致死率始終居高不下。引發(fā)IFIs的常見病原菌包括念珠菌屬、曲霉菌屬和隱球菌屬等,其中以白念珠菌感染最為多見。除了播散性的全身感染,在粘膜、器官以及各種生物材料表面形成生物被膜也是白念珠菌感染人體的常見方式,而生物被膜對目前臨床上絕大部分抗真菌藥物都高度耐藥,給臨床治療造成很大困難。目前臨床上對于IFIs的治療仍然存在很多問題,一方面,臨床用藥選擇有限,而且存在或肝腎毒性大或價格昂貴等問題;另一方面,隨著現有抗真菌藥物的長期使用,真菌耐藥也逐漸成為影響臨床治療的重要問題。因此,尋找新型高效低毒的抗真菌化合物具有切實的意義。天然產物是藥物發(fā)現的資源寶庫。我們課題組前期在天然產物中篩選具有抗真菌活性的小分子化合物,發(fā)現血根堿(sanguinarine,SAN)具有強效的抗真菌作用,并且在進一步的研究中發(fā)現,SAN對生物被膜也有良好的抑制效果,而且抗生物被膜起效濃度低于其最低抑菌濃度。本課題全面考察了SAN的抗真菌活性,并研究了其依賴于濃度的抗真菌作用機制。二、研究方法與結果我們首先通過微量液基稀釋法考察了SAN的抗真菌譜,發(fā)現其對臨床常見致病真菌白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新型隱球菌、煙曲霉菌以及紅色毛癬菌都有較好的抗菌活性,最低抑菌濃度為0.4-6.4 mg/L,其中對白念珠菌的最低抑菌濃度為3.2 mg/L;另外,一些對氟康唑(fluconazole,FLU)耐藥的真菌,SAN也表現出與對敏感菌類似的抗菌活性。為了進一步明確SAN的抗菌作用,我們選取白念珠菌和新型隱球菌為代表,進行瓊脂平皿紙片擴散實驗考察SAN的抑菌圈,并且繪制了SAN的殺菌曲線。結果顯示SAN對兩種菌都表現出劑量依賴的殺菌作用,3.2 mg/L SAN能夠對白念珠菌產生顯著的殺菌作用。隨后我們進行了抗真菌后效應的測定,發(fā)現SAN存在劑量依賴的抗真菌后效應。我們用XTT法考察SAN的抗白念珠菌生物被膜作用,結果顯示SAN在低于最低抑菌濃度的條件下(0.4-1.6 mg/L)即產生抗生物被膜活性;而且SAN不僅能夠抑制初期生物被膜的形成,還能夠破壞已經形成的成熟生物被膜,兩種情況均具有劑量依賴性。我們進而利用小鼠白念珠菌感染模型考察了SAN的體內抗真菌活性,結果表明SAN能劑量依賴地保護真菌感染小鼠,1 mg/kg SAN在體內能夠顯著延長感染小鼠的存活時間并提高小鼠存活率。我們還對SAN的安全性進行了初步的考察,利用MTT法考察SAN對人臍靜脈內皮細胞活性的影響,結果顯示SAN對哺乳動物細胞的毒性相對較低,IC_(50)值為7.8 mg/L,與對白念珠菌的最低抑菌濃度3.2 mg/L之間存在較大治療窗,說明SAN對真菌的抑制作用具有一定的特異性。在對SAN抗真菌機制的探究中,我們分別考察了SAN在低濃度下(≤1.6 mg/L)的抗生物被膜機制和高濃度下(≥3.2 mg/L)的殺浮游菌機制。首先是抗生物被膜機制:我們進行細胞表面疏水性測定,考察SAN對白念珠菌粘附能力的影響,結果表明SAN能夠劑量依賴地降低白念珠菌的細胞表面疏水性;然后我們用幾種不同的菌絲誘導培養(yǎng)基考察SAN對菌絲形成的影響,結果顯示SAN能夠劑量依賴地抑制不同培養(yǎng)基中菌絲的形成;隨后我們用實時熒光定量PCR實驗考察SAN對菌絲和粘附相關基因表達的影響,發(fā)現SAN能夠使cAMP通路相關基因ECE1、HWP1、HGC1、ALS3、CYR1的表達下調,提示SAN的抗生物被膜作用與cAMP通路受抑制有關;于是我們測定了SAN處理后白念珠菌細胞中cAMP的含量,發(fā)現cAMP含量顯著降低,并且外源加入cAMP后白念珠菌的菌絲形成能力得到了恢復。其次我們研究了SAN高濃度下的殺菌機制:我們利用基因芯片技術和iTRAQ技術考察高濃度SAN處理后白念珠菌的基因組轉錄水平和蛋白質表達水平,結果發(fā)現氧化應激相關的基因和蛋白表達都出現明顯的上調,提示細胞內發(fā)生了氧化應激;于是我們用DCFH-DA熒光探針測定了細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,發(fā)現胞內ROS水平顯著升高,而加入抗氧化劑后,SAN的殺菌作用明顯減弱,證明SAN的殺菌作用與ROS水平升高有關;我們利用DAPI染料和TUNEL試劑觀察SAN處理后染色體的凝集現象和DNA鏈斷裂情況,說明SAN處理后細胞遺傳物質受到了損傷,而加入抗氧化劑能使這種損傷減輕;最后我們用Annexin-V-FITC和PI染料考察SAN對白念珠菌凋亡和壞死的影響,結果顯示SAN能夠誘導白念珠菌發(fā)生凋亡,并且抗氧化劑的加入能夠顯著減輕SAN誘導凋亡的作用。三、研究結論SAN抗真菌譜廣、殺菌作用強、具有良好的抗生物被膜活性、體內有效并且毒性較低,是較理想的抗真菌候選先導化合物。SAN在低濃度下(≤1.6 mg/L)通過抑制cAMP通路發(fā)揮抗生物被膜作用;而在高濃度下(≥3.2 mg/L)通過升高細胞內ROS,導致DNA損傷并且誘導細胞凋亡產生殺菌作用。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略詞表
前言
材料與方法
    一、實驗材料
    二、實驗方法
實驗結果
    一、SAN的體外抗真菌作用
        (一)SAN的抗真菌譜
        (二)SAN的體外殺菌作用
        (三)SAN存在抗真菌后效應
        (四)SAN的抗生物被膜作用
    二、SAN的體內抗真菌活性
    三、SAN對哺乳動物細胞的毒性較低
    四、SAN抗白念珠菌的機制
        (一)低濃度條件下SAN的抗生物被膜作用機制
        (二)高濃度條件下SAN的殺菌作用機制
實驗討論
    一、SAN的抗真菌作用
    二、SAN的抗真菌機制
總結
附錄
參考文獻
綜述
    參考文獻
在讀期間發(fā)表論文和參加科研情況說明
致謝

【參考文獻】

相關博士學位論文 前2條

1 胡丹丹;紫檀茋抗白念珠菌生物被膜的作用及自噬影響生物被膜的機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2017年

2 劉遠飛;氟喹諾酮類抗菌藥后效應及其機制的研究[D];東北農業(yè)大學;2002年

相關碩士學位論文 前1條

1 吳晶;中藥抗真菌的活性篩選及作用機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2017年

本文編號：2835949