【摘要】：本文采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)技術(shù)對(duì)菱角殼提取物的乙酸乙酯部分進(jìn)行了研究,建立了11批次不同來(lái)源菱角殼的UPLC指紋圖譜,研究了菱角殼體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性和抗氧化活性,并結(jié)合指紋圖譜進(jìn)行譜效關(guān)系研究。具體內(nèi)容如下:首先,對(duì)菱角殼的提取方法進(jìn)行了研究,建立并優(yōu)化了UPLC指紋圖譜分析方法。獲得較佳的提取條件為:提取溶劑為乙醇/水(V/V,60/40),提取溫度40°C,提取時(shí)間30 min,提取方式為超聲提取,然后過(guò)濾旋干得粗提物,粗提物復(fù)溶于水,并依次用石油醚和乙酸乙酯萃取,優(yōu)選乙酸乙酯層為目標(biāo)層。通過(guò)優(yōu)化色譜分析參數(shù),獲得了較佳的UPLC分析條件:色譜柱:Waters Acquity UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8μm);流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:1.0μL;柱溫:30°C;PDA檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;采用梯度洗脫。該方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。其次,采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)對(duì)菱角殼提取物的乙酸乙酯部分進(jìn)行了初步的成分鑒定,共檢測(cè)到39種化合物,有35種化合物被初步鑒定或標(biāo)識(shí)。其中,菱角殼主要成分為單寧類,包括13種沒食子單寧類和15種鞣花單寧類成分,并對(duì)其裂解機(jī)理進(jìn)行了研究。最后,對(duì)11批次不同來(lái)源菱角殼提取物的乙酸乙酯部分的UPLC指紋圖譜和體外生物活性進(jìn)行了譜效研究。菱角殼UPLC指紋圖譜共匹配得到30個(gè)共有峰。通過(guò)相似度評(píng)價(jià)方法,得到11批次的菱角殼的相似度較高;通過(guò)聚類分析方法,可將菱角殼分為兩大類;通過(guò)主成分分析方法,得到30個(gè)共有峰中的3個(gè)主要成分對(duì)菱角殼分類的貢獻(xiàn)率最大,分別是化合物10(三-O-沒食子酰-D-葡萄糖)、20(三-O-沒食子酰-鞣花酰-D-葡萄糖)和22(1,2,3,6-四-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖)。在11批次菱角殼提取物的HepG2細(xì)胞抗增殖活性研究中發(fā)現(xiàn),在3.13-100.00μg/mL菱角殼給藥濃度范圍內(nèi),當(dāng)菱角殼中沒食子酸單寧類總含量越高時(shí),其IC_(50)值越高,即對(duì)HepG2細(xì)胞的抗增殖活性越弱;當(dāng)菱角殼中鞣花單寧類總含量越高時(shí),其IC_(50)值越低,即對(duì)HepG2細(xì)胞的抗增殖活性越強(qiáng)。結(jié)合化學(xué)結(jié)構(gòu)分析,鞣花�；鶊F(tuán)(HHDP)是決定菱角殼抗增殖能力強(qiáng)弱的決定性基團(tuán)。在11批次菱角殼提取物的DPPH自由基清除能力的抗氧化實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)菱角殼的總成分含量越高時(shí),其抗氧化能力越強(qiáng)。結(jié)合菱角殼中化合物的結(jié)構(gòu)特征分析推測(cè),菱角殼的抗氧化能力與化合物中的羥基個(gè)數(shù)有關(guān),一般羥基個(gè)數(shù)越多,抗氧化能力越強(qiáng)。通過(guò)研究菱角殼指紋圖譜與兩種體外活性間的譜效關(guān)系,可以為菱角殼的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供方法依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R284;R285
【圖文】：

菱角殼化學(xué)成分及體外生物活性研究寧存在的形式不僅僅是以一個(gè)葡萄糖單元為中心，多個(gè)葡萄糖單元為中心的則更為廣泛。王克建等人[57]運(yùn)用 HPLC-ESI/MSn方法對(duì)核桃仁中的化學(xué)成分做了初步鑒定，核桃仁中含有豐富的酚酸類成分，主要以含 HHDP 基團(tuán)的鞣花單寧為主，共鑒定得到 4 種鞣花�；咸烟钱悩�(gòu)體和 2 種二鞣花酰基葡萄糖類異構(gòu)體。除上述常規(guī)的鞣花單寧的結(jié)構(gòu)外，還有一類鞣花單寧的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為葡萄糖C4→C6 位的氧化偶聯(lián)，如 Smeriglio 等[58]在其研究中發(fā)現(xiàn)，化合物 Eugeniin 繼續(xù)進(jìn)行 C2→C3 位氧化偶聯(lián)時(shí)，可形成木麻黃素結(jié)構(gòu)（Casuarictin）。

圖 1-2 縮合單寧的結(jié)構(gòu)特征[60]Figure 1-2. The characteristics of condensed tannins1.2.2 單寧類化合物的藥理作用藥理學(xué)研究表明，單寧具有抗腫瘤細(xì)胞增殖[62]、抗氧化[63]、抗病毒[64]、抗菌[65]和抗炎[63]等作用。（1）抗腫瘤細(xì)胞增殖作用李長(zhǎng)偉等人[62]從南酸棗樹皮中分離出沒食子酸、沒食子酸乙酯和 5 種沒食子單寧類成分（1-O-沒食子�；�-β-D-吡喃葡萄糖、1,4-二-O-沒食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖、1,6-二-O-沒食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖、1,4,6-三-O-沒食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖和 1,3,4,6-四-O-沒食子�；�-β-D-吡喃葡萄糖），分別將其作用于人慢性髓細(xì)胞性白血病 K562 細(xì)胞，用 MTT 法來(lái)評(píng)估其抗增殖活性，除 1-O-沒食子�；�-β-D-吡喃葡萄糖和 1,3,4,6-四-O-沒食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖抗增殖活性較弱以外，其余化合物均對(duì) K562 細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性�？吕锢╟orilagin）是一種典型的沒食子單寧，其結(jié)構(gòu)由一個(gè) HHDP 基團(tuán)

分分析需要運(yùn)用到液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，而三氟乙酸和磷酸在質(zhì)譜中會(huì)有較大殘留，故這兩者不作考慮。相同濃度的 0.1%甲酸和 0.1%乙酸相比較的情況下，0.1%甲酸的分離效果會(huì)更好，而乙酸濃度則要在 1%左右才能達(dá)到與 0.1%甲酸相類似的分離效果，因此，經(jīng)過(guò)綜合考慮，最終確定 ACN-0.1%甲酸為流動(dòng)相體系。（3）柱溫、流速的選擇柱溫和流速是影響色譜分離的另一重要因素，但同時(shí)也影響著系統(tǒng)的耐受壓力。在流速 0.2 mL/min 下，試驗(yàn)了 30-50 °C 不同柱溫的影響；在柱溫 30 °C 下，考察了 0.2-0.3 mL/min 不同流速的影響。結(jié)果表明升高柱溫和加快流速反而會(huì)導(dǎo)致色譜峰共洗脫，出峰變快�？紤]到系統(tǒng)壓力等因素，確定本實(shí)驗(yàn)柱溫為 30 °C，流速為 0.2 mL/min。（4）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇采用 Waters ACQUITY UPLC 的 PDA 檢測(cè)器，在波長(zhǎng)范圍 190-400 nm 下掃描菱角殼提取物供試品溶液的色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與波長(zhǎng)在 254 nm 下的譜圖相比，波長(zhǎng)在 280 nm 下檢測(cè)到的峰較多（圖 2-1），峰的響應(yīng)值較佳，且基線噪音影響小，因此確定 280 nm 為本實(shí)驗(yàn)較佳的吸收波長(zhǎng)。
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本文編號(hào)：2835558