[背景]肝纖維化是對如病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝等各種慢性肝損傷的一種補償性修復(fù)過程。肝臟損傷時,靜息的肝星狀細胞(Hepatic stellate cells,HSCs)轉(zhuǎn)分化為具有增殖、收縮特性的肌成纖維細胞,隨后分泌大量的細胞外基質(zhì),在肝實質(zhì)中積聚并促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。肝星狀細胞增強的收縮性增加了肝竇血流的阻力從而加重了肝竇毛細血管化和重塑,以及促進瘢痕組織攣縮介導(dǎo)肝臟對損傷的反應(yīng)。細胞收縮是一個非常耗能的過程,新進證據(jù)表明HSC活化時,有氧糖酵解是一種更快和更短的能量產(chǎn)生途徑,可用于滿足其快速增殖的高要求。因而,揭示HSC收縮與糖酵解之間的聯(lián)系進而靶向抑制HSC活化收縮成為防治肝纖維化的新策略。越來越多的基礎(chǔ)和臨床研究揭示傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療肝纖維化方面具有確切的療效。本課題組前期研究結(jié)果表明千層紙素A(oroxylinA)作為黃零的重要活性成分之一,其在抗肝纖維化方面具有確切的療效。前期研究發(fā)現(xiàn),千層紙素A可防止肝纖維化中LSEC的血管生成進而防治肝纖維化;千層紙素A也可抑制與HSC自噬誘導(dǎo)相關(guān)的肝纖維化。但我們認為,千層紙素A的抗纖維化作用的潛在機制尚不完全清楚。本研究旨在明確千層紙素A對肝纖維化的防治效應(yīng),研究千層紙素A對HSC收縮的調(diào)節(jié)并闡明潛在的機制。本研究的結(jié)果為開發(fā)千層紙素A作為抗肝纖維化藥物提供實驗依據(jù),為千層紙素A的作用及機理研究提供全新的思路和明確的方向。[方法]1.體外研究選取HSC-LX2細胞株作為本論文體外研究對象。膠原晶格收縮和骨架染色表現(xiàn)HSC收縮;Western Blot和免疫熒光用于檢測磷酸化MLC2蛋白水平;葡萄糖攝取、葡萄糖消耗、乳酸生成、細胞外酸化率試劑盒檢測糖酵解通量及產(chǎn)物水平;Real-Time PCR和Western Blot用于檢測糖酵解限速酶:己糖激酶2、磷酸果糖激酶1和M2型丙酮酸激酶的基因及蛋白水平;ELISA用于檢測糖酵解限速酶活性;過表達質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染用于正反驗證靶點LDH-A效應(yīng)。2.體內(nèi)研究將30只ICR雄性小鼠隨機分為5組(每組6只):正常對照組、CCl4模型組、CC14+千層紙素A處理組、CC14+千層紙素A處理加腺病毒空載體、CC14+千層紙素A處理加腺病毒包裝LDH-A過表達質(zhì)粒。肝組織的HE、Masson、天狼星紅染色表現(xiàn)肝組織結(jié)構(gòu)與膠原沉積現(xiàn)象;α-SMA免疫組化染色表現(xiàn)肝組織中HSC活化;掃描電鏡觀察肝竇毛細管化;試劑盒檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、間接膽紅素水平;ELISA實驗用于檢測血清中透明質(zhì)酸、層粘連蛋白和III型前膠原的表達;Real-time PCR檢測肝組織中目的基因表達、Western blot及免疫熒光雙染檢測肝組織中目的蛋白水平。隨機選取自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院南京市第二醫(yī)院臨床肝纖維化及正常肝臟樣本5例。以Real-time PCR考察肝纖維化患者和正常患者肝臟中LDH-A的基因表達。[結(jié)果]千層紙素A抑制HSC骨架形成及MLC2磷酸化進而抑制HSC收縮,千層紙素A能降低HSC中有氧糖酵解能力,并且抑制有氧糖酵解限速酶己糖激酶2、磷酸果糖激酶1和M2型丙酮酸激酶的基因、蛋白表達和酶活性。糖酵解抑制劑2-DG的加入證實千層紙素A是通過阻斷HSC有氧糖酵解進而抑制HSC收縮。進一步的探索發(fā)現(xiàn)千層紙素A對于LDH-A(有氧糖酵解關(guān)鍵靶標)有顯著的調(diào)控作用,我們發(fā)現(xiàn)LDH-A在肝纖維化患者的肝臟中較正�；颊吒闻K中具有高水平的基因表達,而千層紙素A可以下調(diào)HSC中LDH-A的基因、蛋白表達及其酶活性。接下來LDH-A藥理性抑制劑、LDH-A siRNA、LDH-A過表達質(zhì)粒的加入正反驗證千層紙素A通過下調(diào)LDH-A發(fā)揮其阻斷HSC糖酵解和抑制HSC收縮的作用。最后,體內(nèi)腺病毒包裝LDH-A過表達質(zhì)粒驗證千層紙素A通過對LDH-A的調(diào)控發(fā)揮其抗肝纖維化作用,千層紙素A可降低肝纖維化時升高的血清學(xué)的肝損傷及肝纖維化指標;千層紙素A緩解肝纖維化時肝臟結(jié)構(gòu)的紊亂和膠原的沉積;千層紙素A也抑制了肝纖維化造成的HSC活化以及修復(fù)肝纖維化時消失的窗孔。但千層紙素A對肝纖維化的干預(yù)作用均被LDH-A過表達所阻斷。此外,千層紙素A可阻斷纖維化時升高的HSC收縮行為和HSC有氧糖酵解水平,這一效應(yīng)也被LDH-A過表達抵消。體內(nèi)外結(jié)果表明下調(diào)LDH-A進而抑制HSC有氧糖酵解依賴性收縮是千層紙素A抗肝纖維化作用的基礎(chǔ)。[結(jié)論]本研究將有氧糖酵解途徑與HSC的收縮表型聯(lián)系起來,并發(fā)現(xiàn)千層紙素A通過下調(diào)LDH-A阻斷了HSC有氧糖酵解依賴性收縮并減少了肝纖維化。本研究將LDH-A作為阻斷HSC有氧糖酵解和治療肝纖維化的有希望的靶標,也為千層紙素A調(diào)控LDH-A發(fā)揮抗纖維化的開發(fā)提供了一定的實驗依據(jù)。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖１－１?ＨＳＣ活化??Ｆｉｇ?１－１?Ｓｔｅｌｌａｔｅ?ｃｅｌｌ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．?（Ｄｏｎ?Ｃ．?Ｒｏｃｋｅｙ，?Ｍ．Ｄ．?Ｃｌｉｎ?Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ?Ｈｅｙａｔｏｌ．??

胞（Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＭＦｓ）的細胞的主要來源［４］。在纖維化肝臟中，靜息的ＨＳＣｓ??活化并轉(zhuǎn)分化為具有增殖、收縮特性的肌成纖維細胞，隨后合成并分泌大量的??ＥＣＭ并在肝實質(zhì)中過度沉積從而促進肝纖維化進程（圖１）?ＨＳＣｓ作為肝特??異性周細胞獲得收縮表型的認識是了解這些細胞生物學(xué)的重要里程碑［６］。ＨＳＣｓ??增強的收縮性一方面增加了肝竇血流的阻力從而加重了肝竇毛細血管化和重塑，??另一方面通過加劇慢性肝損傷過程中細胞外基質(zhì)的重塑介導(dǎo)肝臟對損傷的反應(yīng)??［７］。因此，闡明如何調(diào)節(jié)ＨＳＣｓ收縮可能促進慢性肝病的治療策略的發(fā)展。??＾?Ｃｏｒａｎ？ｌＮｌｔｙ?；??１／?＿?Ｉ??Ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ?ｓｉｅｌｌａｔａ?Ａｃｌ？ｖ？ｔｅｄ?ＢｔｅＨａｔｅ?／?：?Ｐ０ＧＦ?Ｒｂｒｏｇｃｎｅ？ｉ＊??ｃｅｌｌ?（ｎｏｒｍａｌ）?ｃｅｌｌ?（Ｉｎｊｉｔｆｅｄ）?／?：?＾??■■Ｊ；?－ｒ－?＼??＇良—一乂?斗－一：：ｉ??＼?Ｉ?＼?＾?＾?｜??｜?Ｍ?｜?＃顯—??丨—。ｎ?！??＂Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ??Ａｕｔｏｐｈａｇｙ??Ｃｅｌｌ?ｆａｔｅ??圖１－１?ＨＳＣ活化??Ｆｉｇ?１－１?Ｓｔｅｌｌａｔｅ?ｃｅｌｌ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．?（Ｄｏｎ?Ｃ．?Ｒｏｃｋｅｙ，?Ｍ．Ｄ．?Ｃｌｉｎ?Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ?Ｈｅｙａｔｏｌ．??１??

Ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ?ＨＳＣ?Ａｃｔｉｖａｔｅｄ?ＨＳＣ??圖１－２?ＨＳＣ有氧糖酵解在ＨＳＣ活化中的作用??Ｆｉｇ?１－２?Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｈｅｐａｔｉｃ?ｓｔｅｌｌａｔｅ?ｃｅｌｌｓ?（ＨＳＣｓ）?ｔｈｒｏｕｇｈ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｅｒｏｂｉｃ??ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ?（Ｗａｒｂｕｒｇ?ｅｆｆｅｃｔ）．?（Ｈｏｕ?Ｗ．?Ｓｖｎ?ＷＫ．?Ｆｒｏｎｔ?Ｃｅｌｌ?Ｄｅｖ?Ｂｉｏｌ．?２０１８．?１２：６：１５０．）??１．３肝星狀細胞有氣糖酵解可能的靶標一ＬＤＨ－Ａ??葡萄糖通過有氧糖酵解被代謝為丙酮酸，其可以在三羧酸（ＴＣＡ）循環(huán)中被??氧化代謝為Ｃ０２，并通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生大量的ＡＴＰ，丙酮酸還可以還原代??謝成有機酸或醇［２Ｇ】。乳酸脫氫酶Ａ?（ＬａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＡ，ＬＤＨ－Ａ）是葡萄糖??消耗以及將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的所必需的，Ｗａｒｂｕｒｇ效應(yīng)中的關(guān)鍵因子＾１。ＬＤＨ－??Ａ通過誘導(dǎo)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，同時將還原型煙酰胺腺嘌呤二核甘酸??（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＡＤＨ）氧化為?ＮＡＤ－丨２２】。其中，糖酵解的中??間產(chǎn)物被腫瘤細胞利用合成蛋白質(zhì)、核酸及脂類等，從而為腫瘤細胞等高增殖性??細胞本身的生長提供了必需的物質(zhì)基礎(chǔ)Ｐ＾４１。許多高增殖性細胞都高水平表達??ＬＤＨ－Ａ
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本文編號：2835771