[背景]肝纖維化是對如病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝等各種慢性肝損傷的一種補(bǔ)償性修復(fù)過程。肝臟損傷時,靜息的肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells,HSCs)轉(zhuǎn)分化為具有增殖、收縮特性的肌成纖維細(xì)胞,隨后分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì),在肝實(shí)質(zhì)中積聚并促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。肝星狀細(xì)胞增強(qiáng)的收縮性增加了肝竇血流的阻力從而加重了肝竇毛細(xì)血管化和重塑,以及促進(jìn)瘢痕組織攣縮介導(dǎo)肝臟對損傷的反應(yīng)。細(xì)胞收縮是一個非常耗能的過程,新進(jìn)證據(jù)表明HSC活化時,有氧糖酵解是一種更快和更短的能量產(chǎn)生途徑,可用于滿足其快速增殖的高要求。因而,揭示HSC收縮與糖酵解之間的聯(lián)系進(jìn)而靶向抑制HSC活化收縮成為防治肝纖維化的新策略。越來越多的基礎(chǔ)和臨床研究揭示傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療肝纖維化方面具有確切的療效。本課題組前期研究結(jié)果表明千層紙素A(oroxylinA)作為黃零的重要活性成分之一,其在抗肝纖維化方面具有確切的療效。前期研究發(fā)現(xiàn),千層紙素A可防止肝纖維化中LSEC的血管生成進(jìn)而防治肝纖維化;千層紙素A也可抑制與HSC自噬誘導(dǎo)相關(guān)的肝纖維化。但我們認(rèn)為,千層紙素A的抗纖維化作用的潛在機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在明確千層紙素A對肝纖維化的防治效應(yīng),研究千層紙素A對HSC收縮的調(diào)節(jié)并闡明潛在的機(jī)制。本研究的結(jié)果為開發(fā)千層紙素A作為抗肝纖維化藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為千層紙素A的作用及機(jī)理研究提供全新的思路和明確的方向。[方法]1.體外研究選取HSC-LX2細(xì)胞株作為本論文體外研究對象。膠原晶格收縮和骨架染色表現(xiàn)HSC收縮;Western Blot和免疫熒光用于檢測磷酸化MLC2蛋白水平;葡萄糖攝取、葡萄糖消耗、乳酸生成、細(xì)胞外酸化率試劑盒檢測糖酵解通量及產(chǎn)物水平;Real-Time PCR和Western Blot用于檢測糖酵解限速酶:己糖激酶2、磷酸果糖激酶1和M2型丙酮酸激酶的基因及蛋白水平;ELISA用于檢測糖酵解限速酶活性;過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染用于正反驗(yàn)證靶點(diǎn)LDH-A效應(yīng)。2.體內(nèi)研究將30只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為5組(每組6只):正常對照組、CCl4模型組、CC14+千層紙素A處理組、CC14+千層紙素A處理加腺病毒空載體、CC14+千層紙素A處理加腺病毒包裝LDH-A過表達(dá)質(zhì)粒。肝組織的HE、Masson、天狼星紅染色表現(xiàn)肝組織結(jié)構(gòu)與膠原沉積現(xiàn)象;α-SMA免疫組化染色表現(xiàn)肝組織中HSC活化;掃描電鏡觀察肝竇毛細(xì)管化;試劑盒檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、間接膽紅素水平;ELISA實(shí)驗(yàn)用于檢測血清中透明質(zhì)酸、層粘連蛋白和III型前膠原的表達(dá);Real-time PCR檢測肝組織中目的基因表達(dá)、Western blot及免疫熒光雙染檢測肝組織中目的蛋白水平。隨機(jī)選取自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院南京市第二醫(yī)院臨床肝纖維化及正常肝臟樣本5例。以Real-time PCR考察肝纖維化患者和正�；颊吒闻K中LDH-A的基因表達(dá)。[結(jié)果]千層紙素A抑制HSC骨架形成及MLC2磷酸化進(jìn)而抑制HSC收縮,千層紙素A能降低HSC中有氧糖酵解能力,并且抑制有氧糖酵解限速酶己糖激酶2、磷酸果糖激酶1和M2型丙酮酸激酶的基因、蛋白表達(dá)和酶活性。糖酵解抑制劑2-DG的加入證實(shí)千層紙素A是通過阻斷HSC有氧糖酵解進(jìn)而抑制HSC收縮。進(jìn)一步的探索發(fā)現(xiàn)千層紙素A對于LDH-A(有氧糖酵解關(guān)鍵靶標(biāo))有顯著的調(diào)控作用,我們發(fā)現(xiàn)LDH-A在肝纖維化患者的肝臟中較正�；颊吒闻K中具有高水平的基因表達(dá),而千層紙素A可以下調(diào)HSC中LDH-A的基因、蛋白表達(dá)及其酶活性。接下來LDH-A藥理性抑制劑、LDH-A siRNA、LDH-A過表達(dá)質(zhì)粒的加入正反驗(yàn)證千層紙素A通過下調(diào)LDH-A發(fā)揮其阻斷HSC糖酵解和抑制HSC收縮的作用。最后,體內(nèi)腺病毒包裝LDH-A過表達(dá)質(zhì)粒驗(yàn)證千層紙素A通過對LDH-A的調(diào)控發(fā)揮其抗肝纖維化作用,千層紙素A可降低肝纖維化時升高的血清學(xué)的肝損傷及肝纖維化指標(biāo);千層紙素A緩解肝纖維化時肝臟結(jié)構(gòu)的紊亂和膠原的沉積;千層紙素A也抑制了肝纖維化造成的HSC活化以及修復(fù)肝纖維化時消失的窗孔。但千層紙素A對肝纖維化的干預(yù)作用均被LDH-A過表達(dá)所阻斷。此外,千層紙素A可阻斷纖維化時升高的HSC收縮行為和HSC有氧糖酵解水平,這一效應(yīng)也被LDH-A過表達(dá)抵消。體內(nèi)外結(jié)果表明下調(diào)LDH-A進(jìn)而抑制HSC有氧糖酵解依賴性收縮是千層紙素A抗肝纖維化作用的基礎(chǔ)。[結(jié)論]本研究將有氧糖酵解途徑與HSC的收縮表型聯(lián)系起來,并發(fā)現(xiàn)千層紙素A通過下調(diào)LDH-A阻斷了HSC有氧糖酵解依賴性收縮并減少了肝纖維化。本研究將LDH-A作為阻斷HSC有氧糖酵解和治療肝纖維化的有希望的靶標(biāo),也為千層紙素A調(diào)控LDH-A發(fā)揮抗纖維化的開發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖１－１?ＨＳＣ活化??Ｆｉｇ?１－１?Ｓｔｅｌｌａｔｅ?ｃｅｌｌ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．?（Ｄｏｎ?Ｃ．?Ｒｏｃｋｅｙ，?Ｍ．Ｄ．?Ｃｌｉｎ?Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ?Ｈｅｙａｔｏｌ．??

胞（Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＭＦｓ）的細(xì)胞的主要來源［４］。在纖維化肝臟中，靜息的ＨＳＣｓ??活化并轉(zhuǎn)分化為具有增殖、收縮特性的肌成纖維細(xì)胞，隨后合成并分泌大量的??ＥＣＭ并在肝實(shí)質(zhì)中過度沉積從而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程（圖１）?ＨＳＣｓ作為肝特??異性周細(xì)胞獲得收縮表型的認(rèn)識是了解這些細(xì)胞生物學(xué)的重要里程碑［６］。ＨＳＣｓ??增強(qiáng)的收縮性一方面增加了肝竇血流的阻力從而加重了肝竇毛細(xì)血管化和重塑，??另一方面通過加劇慢性肝損傷過程中細(xì)胞外基質(zhì)的重塑介導(dǎo)肝臟對損傷的反應(yīng)??［７］。因此，闡明如何調(diào)節(jié)ＨＳＣｓ收縮可能促進(jìn)慢性肝病的治療策略的發(fā)展。??＾?Ｃｏｒａｎ？ｌＮｌｔｙ?；??１／?＿?Ｉ??Ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ?ｓｉｅｌｌａｔａ?Ａｃｌ？ｖ？ｔｅｄ?ＢｔｅＨａｔｅ?／?：?Ｐ０ＧＦ?Ｒｂｒｏｇｃｎｅ？ｉ＊??ｃｅｌｌ?（ｎｏｒｍａｌ）?ｃｅｌｌ?（Ｉｎｊｉｔｆｅｄ）?／?：?＾??■■Ｊ；?－ｒ－?＼??＇良—一乂?斗－一：：ｉ??＼?Ｉ?＼?＾?＾?｜??｜?Ｍ?｜?＃顯—??丨—。ｎ?！??＂Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ??Ａｕｔｏｐｈａｇｙ??Ｃｅｌｌ?ｆａｔｅ??圖１－１?ＨＳＣ活化??Ｆｉｇ?１－１?Ｓｔｅｌｌａｔｅ?ｃｅｌｌ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．?（Ｄｏｎ?Ｃ．?Ｒｏｃｋｅｙ，?Ｍ．Ｄ．?Ｃｌｉｎ?Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ?Ｈｅｙａｔｏｌ．??１??

Ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ?ＨＳＣ?Ａｃｔｉｖａｔｅｄ?ＨＳＣ??圖１－２?ＨＳＣ有氧糖酵解在ＨＳＣ活化中的作用??Ｆｉｇ?１－２?Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｈｅｐａｔｉｃ?ｓｔｅｌｌａｔｅ?ｃｅｌｌｓ?（ＨＳＣｓ）?ｔｈｒｏｕｇｈ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｅｒｏｂｉｃ??ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ?（Ｗａｒｂｕｒｇ?ｅｆｆｅｃｔ）．?（Ｈｏｕ?Ｗ．?Ｓｖｎ?ＷＫ．?Ｆｒｏｎｔ?Ｃｅｌｌ?Ｄｅｖ?Ｂｉｏｌ．?２０１８．?１２：６：１５０．）??１．３肝星狀細(xì)胞有氣糖酵解可能的靶標(biāo)一ＬＤＨ－Ａ??葡萄糖通過有氧糖酵解被代謝為丙酮酸，其可以在三羧酸（ＴＣＡ）循環(huán)中被??氧化代謝為Ｃ０２，并通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生大量的ＡＴＰ，丙酮酸還可以還原代??謝成有機(jī)酸或醇［２Ｇ】。乳酸脫氫酶Ａ?（ＬａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＡ，ＬＤＨ－Ａ）是葡萄糖??消耗以及將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的所必需的，Ｗａｒｂｕｒｇ效應(yīng)中的關(guān)鍵因子＾１。ＬＤＨ－??Ａ通過誘導(dǎo)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，同時將還原型煙酰胺腺嘌呤二核甘酸??（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＡＤＨ）氧化為?ＮＡＤ－丨２２】。其中，糖酵解的中??間產(chǎn)物被腫瘤細(xì)胞利用合成蛋白質(zhì)、核酸及脂類等，從而為腫瘤細(xì)胞等高增殖性??細(xì)胞本身的生長提供了必需的物質(zhì)基礎(chǔ)Ｐ＾４１。許多高增殖性細(xì)胞都高水平表達(dá)??ＬＤＨ－Ａ
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本文編號：2835771