衰老(Aging)是生物個體隨年齡增長而發(fā)生的不可逆的退行性變化。目前,人口老齡化已成為全球性的社會問題。為了延緩衰老,臨床上常使用一些合成的抗氧化劑來清除體內(nèi)自由基及代謝廢物,但長期用藥會對機體產(chǎn)生毒副作用。因此,探索和開發(fā)天然抗氧化劑對于延緩衰老具有重要意義。糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一種全球性的內(nèi)分泌代謝疾病,常伴隨著各種急慢性并發(fā)癥的發(fā)生,致死率高。目前,糖尿病的主要治療方法包括注射胰島素和口服降血糖藥物,但這些方法在長期使用中會產(chǎn)生毒副作用,因此,尋找高效、無毒的天然降血糖藥物仍是醫(yī)學(xué)界的重要研究課題。杏鮑菇[Pleurotus eryngii(DC.etFr.)Quel.]是我國廣泛栽培的一種食藥兼?zhèn)涞恼湎∞?具有豐富的營養(yǎng)價值和廣泛的生物活性。本課題以杏鮑菇(P.eryngii)為出發(fā)菌株,進(jìn)行液體深層發(fā)酵獲得菌絲體。通過水提醇沉法獲得杏鮑菇菌絲體多糖(P.eryngii mycelia polysaccharides,PMPS),分離純化后得到PMPS-1和PMPS-2,并對兩種多糖的結(jié)構(gòu)及其抗衰老、抗糖尿病的生理活性進(jìn)行研究,研究結(jié)果如下:(1)杏鮑菇菌絲體多糖的提取及分離純化:為保持多糖的生物活性,采用較為溫和的水提醇沉法提取多糖,去蛋白處理后,PMPS得率為22.89±1.73mg/g。采用DEAE-52纖維素離子交換柱層析和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析對PMPS進(jìn)行分級純化,得到純化組分PMPS-1和PMPS-2,得率分別為463.42±25.09mg/g和287.65±16.71mg/g。(2)杏鮑菇菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)測定:(1)紫外掃描光譜(Ultraviolet spectrum)分析結(jié)果表明,PMPS-1和PMPS-2均不含蛋白質(zhì)和核酸。(2)高效液相色譜(High pressure liquid chromatograph,HPLC)分析結(jié)果表明,杏鮑菇PMPS-1為不均一多糖,重均分子量(Weight-average molecularweight,Mw)為3.24×10~5Da;杏鮑菇PMPS-2為均一多糖,Mw為1.95×10~4Da。(3)氣相色譜(Gas chromatograph,GC)分析結(jié)果顯示,PMPS-1含有甘露糖和葡萄糖,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.13%和87.87%,摩爾比為1.00:7.24;PMPS-2含有木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.21%、17.47%、14.66%和64.66%,摩爾比為1.00:4.54:3.81:16.79。(4)紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析結(jié)果顯示,PMPS-1和PMPS-2均為β-型糖苷鍵連接的呋喃糖。(5)掃描電鏡結(jié)果說明,PMPS-1分子量較大,可能具有長鏈結(jié)構(gòu)或多分枝結(jié)構(gòu),分子之間作用力較小,易產(chǎn)生交叉粘連;PMPS-2分子量較小,分子間相互作用力相對較大,可能形成緊密的結(jié)構(gòu)。(3)杏鮑菇菌絲體多糖抗氧化及抗衰老功效:(1)體外抗氧化試驗表明,杏鮑菇PMPS-1和PMPS-2具有清除羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的能力。PMPS-2的抗氧化能力強于PMPS-1,可能與PMPS-2具備較低的分子量、單糖組成中含有木糖和半乳糖等結(jié)構(gòu)特征相關(guān)。(2)體內(nèi)抗氧化試驗證明,杏鮑菇PMPS-1和PMPS-2可以顯著抑制小鼠體重和胸腺指數(shù)的異常降低,提高組織器官中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)和總抗氧化能力(Total antioxidant capability,T-AOC)活性,降低丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,提高皮膚組織含水率及羥脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)含量,表明PMPS-1和PMPS-2具有較強抵制氧化應(yīng)激的活性。(3)對肝臟、大腦、皮膚和胸腺的組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明,PMPS-1和PMPS-2能夠減少組織中壞死及凋亡細(xì)胞的數(shù)量,緩解氧化應(yīng)激對組織器官的病理性損傷。(4)杏鮑菇菌絲體多糖降血糖及抗糖尿病功效:(1)體外試驗表明,PMPS-1和PMPS-2對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制活性,且PMPS-2的抑制效果強于PMPS-1。(2)對小鼠空腹血糖的影響:PMPS-1和PMPS-2灌胃處理能夠降低糖尿病小鼠血糖水平。(3)對小鼠氧化應(yīng)激的影響:PMPS-1和PMPS-2均能顯著抑制糖尿病小鼠肝臟、腎臟和胰臟組織中SOD、GSH-Px、過氧化氫酶(Catalase,CAT)和T-AOC活性的降低及脂質(zhì)過氧化物(Lipid peroxide,LPO)和MDA水平的升高,對氧化應(yīng)激引起的肝臟、腎臟和胰臟的損傷有較強的保護(hù)作用。(4)對小鼠脂代謝的影響:PMPS-1和PMPS-2能顯著抑制糖尿病小鼠血清中甘油三酯(Triacylglycerols,TG)、總膽固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和極低密度脂蛋白膽固醇(Very low-density lipoprotein cholesterol,VLDL-C)水平的升高以及高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平的降低,表明杏鮑菇菌絲體多糖能夠改善小鼠的脂代謝紊亂情況。(5)對小鼠血清中炎癥因子的影響:PMPS-1和PMPS-2能顯著抑制糖尿病小鼠血清中核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)水平的升高,說明杏鮑菇菌絲體多糖能夠減輕糖尿病小鼠機體的炎癥反應(yīng)。(6)杏鮑菇菌絲體多糖對糖尿病小鼠器官的修復(fù)作用:PMPS-1和PMPS-2可顯著降低小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase,AST)的活性,降低尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(Creatinine,CRE)的水平,提高白蛋白(Albumin,ALB)水平,抑制器官指數(shù)的升高,以及減輕小鼠肝臟、腎臟和胰臟的病理學(xué)損傷,說明杏鮑菇菌絲體多糖能夠在高糖狀態(tài)下保護(hù)肝臟、腎臟和胰臟免受損傷。上述結(jié)果表明,PMPS-1和PMPS-2具有體外和體內(nèi)抗氧化活性,能夠減輕氧化應(yīng)激損傷,延緩衰老;同時能改善糖尿病小鼠的糖代謝和脂代謝,減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對機體的損傷,對糖尿病及其并發(fā)癥有預(yù)防和治療作用。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R284.2;R285
【部分圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文液分別置于 6 個 100mL 容量瓶中，加水定容，振蕩搖勻，得葡萄糖稀釋4）制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別精密量取 6 種濃度的葡萄糖稀釋液 2mL 于以 2mL 去離子水作空白對照，分別加入配好的 5.5%苯酚溶液 1mL，振入濃硫酸 5mL，立即搖勻，于 40℃水浴鍋靜置 30min，取出后冷水浴 5 波長處測定 OD 值，以吸光度 OD490nm為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（μg/mL）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸曲線（圖 2-1）。回歸方程 y=0.0139x-0.0107（R2=0.

菇菌絲體生物量后的杏鮑菇菌絲體為大小均勻的乳白色顆粒，有杏仁清香，經(jīng)稱重、菌絲體生物量為 4.62g/L。菇菌絲體多糖的分離純化蛋白質(zhì)并進(jìn)行冷凍干燥處理后的杏鮑菇菌絲多糖（PMPS）為乳白色PMPS 的得率為 22.89±1.73mg/g。E-52 纖維素離子交換柱層析1 顯示，杏鮑菇菌絲多糖（PMPS）經(jīng)過 DEAE-52 纖維素離子交換柱分，分別命名為 PMPS-1 和 PMPS-2，分別由去離子水和 0.2mol/LNS-1 和 PMPS-2 的得率分別為 463.42±25.09mg/g 和 287.65±16.71mg/

圖 3-2 PMPS-1 的 Sephadex G-100 葡聚糖凝膠柱洗脫曲線Fig. 3-2 Elution curves of PMPS-1 on Sephadex G-100 column圖 3-3 PMPS-2 的 Sephadex G-100 葡聚糖凝膠柱洗脫曲線
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