肝臟是人體內(nèi)重要的代謝器官,它負(fù)責(zé)人體的新陳代謝和某些外源性化合物的解毒。但同時(shí),在肝臟的代謝和解毒過程中產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致急性和慢性的肝損傷,如果損傷無法修復(fù),肝功能會(huì)受到影響,造成嚴(yán)重的后果。目前,肝病已成為了影響人類健康的最常見的疾病之一,肝組織的壞死、炎癥、纖維化、癌癥等給患者帶來了巨大的痛苦。近年來,植物多糖因其具有多種藥理活性,且來源廣泛、毒性較低,越來越受到科研工作者的重視。紅景天作為一種作用廣泛的傳統(tǒng)中藥,它的使用已有千年歷史。多糖作為紅景天的主要活性成分之一,對(duì)其研究的較少,因此本課題的研究主要是從傳統(tǒng)藥用植物紅景天提取出天然活性產(chǎn)物多糖,對(duì)其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析,評(píng)價(jià)紅景天多糖體內(nèi)的保肝作用,并制備成多糖納米脂質(zhì)體促進(jìn)保肝藥效。第一章綜述本章主要分為兩部分,第一部分對(duì)多糖目前的提取分離純化技術(shù),結(jié)構(gòu)解析方法進(jìn)行了綜述,著重介紹了近5年來多糖結(jié)構(gòu)解析方法的研究進(jìn)展。第二部分主要對(duì)紅景天多糖的結(jié)構(gòu)、生物活性和制劑應(yīng)用三個(gè)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。為本課題研究從紅景天中分離純化出單一多糖組分、并進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析、活性測(cè)定以及制劑制備提供了理論支撐和研究方向。第二章紅景天多糖的分離純化及理化性質(zhì)研究本章采用水提醇沉從紅景天的根莖中得到紅景天粗多糖。使用sevage法脫蛋白,脫去蛋白質(zhì)81.07%,大孔樹脂D315對(duì)其進(jìn)行脫色,脫色效果較好。粗多糖進(jìn)一步經(jīng)纖維素DEAE-52柱和Sephadex G-100凝膠柱分離純化,得到兩種純化多糖組分RRP1和RRP2。第一個(gè)是纖維素DEAE-52的水洗脫組分,命名為RRP1,第二個(gè)是纖維素0.1 M Nacl洗脫組分進(jìn)一步過凝膠Sephadex G-100后水洗脫組分,命名為RRP2。對(duì)RRP1和RRP2進(jìn)行了理化性質(zhì)測(cè)定,結(jié)果表明RRP1含有89.31±1.18%多糖,4.97±0.54%蛋白質(zhì)和0.90±0.21%糖醛酸。RRP2含有80.19±1.68%多糖,14.26±0.59%糖醛酸和2.12±0.37%蛋白質(zhì)。兩種多糖的紫外光譜顯示含有微量的蛋白和核酸。使用HPLC-ELSD進(jìn)行了分子量測(cè)定,HPLC圖譜顯示RRP1和RRP2均為單一對(duì)稱峰,分子量分別為5.5 kDa和425.7 kDa。第三章紅景天多糖RRP1和RRP2的結(jié)構(gòu)特征研究本章對(duì)紅景天多糖(RRP1和RRP2)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,采用了化學(xué)分析法和儀器分析法相結(jié)合測(cè)定分析了紅景天多糖的單糖組成、糖苷鍵位置、特征性官能團(tuán)、糖苷鍵的類型以及表面形態(tài)等。主要包括:采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定了RRP1和RRP2的單糖組成,結(jié)果表明,RRP1和RRP2均由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成,但摩爾比不同,分別為0.69:0.1:0.15:1:0.51:7.5和0.15:0.19:1.01:0.18:0.47:1。紅外光譜顯示RRP1和RRP2均存在吡喃糖環(huán)和糖醛酸。同時(shí),RRP1是以α-型和β-型糖苷鍵連接,而RRP2只含有α-糖苷鍵。核磁共振分析則進(jìn)一步驗(yàn)證了RRP1和RRP2由五種單糖組成以及它們的糖苷鍵類型。高碘酸氧化和Smith降解分析推測(cè),RRP1中阿拉伯糖和葡萄糖主要以1→3連接,甘露糖,鼠李糖和半乳糖主要是由1→2,6、1→6、1→2或1→4連接。RRP2中,鼠李糖,葡萄糖和半乳糖主要以1→3連接,存在甘油和赤蘚糖醇表明在RRP2中的甘露糖和阿拉伯糖主要是由1→2、1→6、或1→4連接。X射線衍射結(jié)果表明RRP1和RRP2都是半結(jié)晶物質(zhì),剛果紅實(shí)驗(yàn)得到的信息是RRP1具有三螺旋構(gòu)象,而RRP2不具有三螺旋構(gòu)象。掃描電鏡(SEM)觀察顯示,RRP1粉末的表面呈現(xiàn)出層狀和不規(guī)則的樹枝狀結(jié)構(gòu),而RRP2具有褶皺的片狀結(jié)構(gòu),邊緣上有滴狀凸起。原子粒顯微鏡(AFM)檢測(cè)表明,RRP1為鏈狀結(jié)構(gòu),寬度或長(zhǎng)度范圍是從1.2μm至2.5μm;其高度約為1-3.5 nm,說明有分子聚集。RRP2表現(xiàn)出不同尺寸(40-200 nm)的顆粒,這些顆粒的高度范圍約在1-4.5 nm,同樣有分子聚集在一起。第四章紅景天多糖的體外抗氧化活性測(cè)定和體內(nèi)保肝作用的研究本章首先測(cè)定了RRP1和RRP2的體外抗氧化活性。結(jié)果表明,與多糖RRP2相比,RRP1具有顯著的體外抗氧化作用,其DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除率分別能達(dá)到90.54%、83.55%和72.50%,并與劑量正相關(guān)。成功建立了四氯化碳(CCl_4)誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型,通過給藥不同計(jì)量的RRP1和RRP2,評(píng)價(jià)了其保肝活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與模型組相比,多糖RRP1顯著降低了血清中ALT和AST水平以及肝組織中MDA含量,增加了肝組織中CAT、SOD和GSH水平,并且RRP1的各劑量組均達(dá)到了顯著性的效果。組織切片可以看到,CCl_4可引起小鼠肝細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化,而多糖RRP1能夠減輕小鼠的肝細(xì)胞損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)面積減少。同時(shí)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明RRP1各劑量組比相同劑量的RRP2顯示出更好的肝保護(hù)作用。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均指出,RRP1具有較好的抗氧化活性和對(duì)CCl_4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的肝保護(hù)作用。第五章紅景天多糖RRP1脂質(zhì)體的制備及其保肝藥效評(píng)價(jià)本章采用逆相蒸發(fā)法制備了紅景天多糖RRP1的脂質(zhì)體(RRP1L),以包封率為指標(biāo),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面分析(選用Box-Behnken模型)優(yōu)化了制備處方,并考察了最優(yōu)處方制備出的脂質(zhì)體的包封率、平均粒徑、形態(tài)和穩(wěn)定性等指標(biāo)。通過建立四氯化碳(CCl_4)誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的動(dòng)物模型,以相同劑量的紅景天多糖組分RRP1做對(duì)照,連續(xù)給藥7天,考察了脂質(zhì)體RRP1L的保肝效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,紅景天多糖RRP1脂質(zhì)體制備的最優(yōu)處方是,磷脂多糖比為29.17:1,磷脂膽固醇比為6.98:1,磷脂吐溫80比為9.20:1,旋蒸溫度為60℃,按照此處方制備的脂質(zhì)體包封率為73.94±1.16%,與模型的預(yù)測(cè)值接近。質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,RRP1L的形狀呈類球形,平均粒徑測(cè)定為137.32±7.28nm,分散性系數(shù)測(cè)定(PDI)為0.198±0.006。Zeta電位測(cè)定為-28.50±0.98 mV,表明RRP1L大小均勻,穩(wěn)定性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果同樣表明,脂質(zhì)體RRP1L在15天常溫條件下未出現(xiàn)明顯的沉淀,包封率降低不顯著,穩(wěn)定性良好。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在連續(xù)給藥7天后,與模型組相比,脂質(zhì)體RRP1L給藥組降低了血清中ALT和AST水平以及肝組織中MDA含量,增加了肝組織中CAT、SOD的活性和GSH的含量,RRP1L具有較好的保肝效果。在與相同劑量的多糖RRP1給藥組比較下,各項(xiàng)指標(biāo)的結(jié)果均表明,脂質(zhì)體RRP1L給藥組比直接給藥多糖RRP1在保護(hù)肝臟效果方面表現(xiàn)的更好,具有應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R284;R285
【部分圖文】：

圖 2.1 紅景天多糖分離純化流程Figure 2.1 The isolation and purification process of Rhodiola rosea polysaccharides2.2.3 多糖組分 RRP1 和 RRP2 的理化性質(zhì)測(cè)定2.2.3.1 RRP1 和 RRP2 的多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，按照 Duboi 等報(bào)道的方法并做了一些小的修改[57]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將 D-葡萄糖（10mg）標(biāo)準(zhǔn)品用適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL 的容量瓶中并定容，配制成 0.1 mg/mL 的葡萄糖溶液。然后分別吸取 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 10 mL 試管中，各試管加蒸餾水補(bǔ)至 0.5 mL，以0.5 mL 蒸餾水作為空白。然后再加入預(yù)先配制的苯酚水溶液（5%）0.8 mL，渦旋混合均勻，再加入濃硫酸 3.5 mL，渦旋混合均勻，室溫條件下放 25 min，于490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。將濃度設(shè)定為 x 軸，將吸光度值設(shè)定為 y 軸，繪制

圖 2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 2.2 Standard curve of glucoseRP1 和 RRP2 的蛋白含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)方法（Bradford 法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量[58]。的配制：將牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（100mg）置于燒杯中，加適量蒸餾轉(zhuǎn)到 1L 的容量瓶中，繼續(xù)加蒸餾水定容，配置出濃度是 0.1mg/質(zhì)溶液。精確稱取考馬斯亮藍(lán)（G250）100mg，用適量蒸餾水溶解瓶中，倒入 50 ml 95%的乙醇與 100 mL 85%的磷酸，用蒸餾水定容曲線的繪制：分別吸取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，每管加入蒸餾水補(bǔ)到 1 mL，以蒸餾水做空白。然后分別在各管

圖 2.3 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 2.3 Standard curve of bovine serum albumin.3 RRP1 和 RRP2 的糖醛酸含量測(cè)定根據(jù)硫酸咔唑法測(cè)定糖醛酸含量[59]。溶液的配制：將葡萄糖醛酸（10 mg）置于燒杯中用適量蒸餾水溶解，00mL 的容量瓶中并定容，配制成 100μg/mL 的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。酸鈉 1.195g 溶于 250mL 濃硫酸中。稱取咔唑 75mg，加入無水乙醇 50為 0.15%。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取半乳糖醛酸溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、 于 10 mL 具塞玻璃試管中，每管加蒸餾水至 1 mL，然后分別加入 5 鈉-硫酸溶液，渦旋混合均勻，于沸水中加熱 10 min，拿出冷卻至室溫

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2833998