目的:探討何首烏飲及其單體化合物對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞衰老關(guān)鍵基因甲基化調(diào)控機(jī)制研究方法:1.差異貼壁法分離、培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cell,LC),采用3β-HSD細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示Leydig細(xì)胞的純度可達(dá)90%以上。2.采用自由基氧化損傷方法建立Leydig細(xì)胞衰老模型,檢測β-半乳糖苷酶的表達(dá)水平,判斷衰老模型是否成功。根據(jù)H_2O_2和FeSO_4不同的用量和作用時(shí)間,β-半乳糖苷酶的陽性表達(dá)水平,確定建立細(xì)胞衰老模型的最適條件。3.依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃檎＝M、衰老組、何首烏飲組、淫羊藿苷組、松果菊苷組、齊墩果酸組和二苯乙烯苷組。并采用MTT法篩選淫羊藿苷、松果菊苷、齊墩果酸和二苯乙烯苷作用于Leydig細(xì)胞的最適濃度。4.運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測各組表觀遺傳關(guān)鍵基因Ttc29、AXL、wnt2b、MAPK10和C-myb的mRNA表達(dá)水平。5.運(yùn)用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)檢測各組表觀遺傳關(guān)鍵基因Ttc29、AXL、wnt2b、MAPK10和C-myb的甲基化水平。6.采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)檢測各組表觀遺傳基因Ttc29、AXL、wnt2b、MAPK10和C-myb啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3、H3K9me3和H3K9me2的富集。7.采用雙因素和單因素方差分析法對(duì)MTT結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析,相關(guān)性分析采用Person法,其余均采用單因素方差分析。結(jié)果:1.根據(jù)不同條件下β-半乳糖苷酶的陽性表達(dá)水平,最終確定細(xì)胞衰老模型的條件為:H_2O_2和FeSO_4的終濃度分別為50μmoL·L~(-1)和100μmoL·L~(-1),體積各為2μL,作用時(shí)間為8 h。2.MTT法確定藥物作用于Leydig細(xì)胞作用72 h的濃度為:淫羊藿苷40μM,松果菊苷20μM,齊墩果酸20μM,二苯乙烯苷50μM。3.何首烏飲及其單體化合物對(duì)Ttc29的甲基化調(diào)控作用3.1 mRNA表達(dá)水平:與正常組比較,衰老組表達(dá)水平明顯升高(P0.05);何首烏飲組、齊墩果酸組和二苯乙烯苷組表達(dá)水平明顯低于衰老組(P0.05),淫羊藿苷組和松果菊苷組與衰老組無顯著性差異(P0.05);其中,何首烏飲組效果最好(P0.05)。3.2甲基化水平:與正常組比較,衰老組甲基化水平明顯升高(P0.05);何首烏飲組、淫羊藿苷組、松果菊苷組、齊墩果酸組和二苯乙烯苷組的甲基化百分比明顯低于衰老組(P0.05);其中,何首烏飲組效果最好(P0.05)。3.3組蛋白甲基化:Ttc29啟動(dòng)子區(qū)域未檢測到H3K27me3,H3K9me3和H3K9me2的富集。4.何首烏飲及其單體化合物對(duì)AXL的甲基化調(diào)控作用4.1 mRNA表達(dá)水平:與正常組比較,衰老組表達(dá)水平明顯升高(P0.05);何首烏飲組、淫羊藿苷組和松果菊苷組表達(dá)水平明顯低于衰老組(P0.05);齊墩果酸與衰老組無顯著性差異(P0.05);其中,何首烏飲組效果最好(P0.05)。4.2甲基化水平:與正常組比較,衰老組甲基化水平明顯降低(P0.05);何首烏飲組、齊墩果酸組和二苯乙烯苷組的甲基化百分比顯著高于衰老組(P0.05);淫羊藿苷組、松果菊苷組與衰老組無顯著性差異(P0.05);其中,何首烏飲組效果最好(P0.05)。4.3組蛋白甲基化:AXL啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3富集極低,幾乎檢測不到H3K9me3和H3K9me2。5.何首烏飲及其單體化合物對(duì)wnt2b的甲基化調(diào)控作用5.1 mRNA表達(dá)水平:與正常組比較,衰老組表達(dá)水平明顯升高(P0.05);何首烏飲組和二苯乙烯苷組表達(dá)水平明顯低于衰老組(P0.05);淫羊藿苷、松果菊苷和齊墩果酸與衰老組無顯著性差異(P0.05);其中,何首烏飲組效果最好(P0.05)。5.2甲基化水平:與正常組比較,衰老組甲基化水平明顯降低(P0.05);與衰老組比較,何首烏飲組、淫羊藿苷組、松果菊苷組和二苯乙烯苷組的甲基化百分比明顯升高(P0.05);齊墩果酸組與衰老組無顯著性差異(P0.05);其中,何首烏飲組效果最好(P0.05)。5.3組蛋白甲基化:與正常組相比較,衰老組wnt2b啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3富集顯著降低(P0.05),而H3K9me3和H3K9me2的富集差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);何首烏飲組、淫羊藿苷組、齊墩果酸組和二苯乙烯苷組wnt2b啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3富集明顯高于衰老組(P0.05),而松果菊苷組與衰老組之間無顯著性差異(P0.05)。何首烏飲組及各單體化合物組與衰老組比較,H3K9me3和H3K9me2的富集差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.何首烏飲及其單體化合物對(duì)C-myb的甲基化調(diào)控作用6.1 mRNA表達(dá)水平:與正常組比較,衰老組表達(dá)水平明顯降低(P0.05);何首烏飲組、淫羊藿苷組、松果菊苷組、齊墩果酸組和二苯乙烯苷組表達(dá)水平明顯高于衰老組(P0.05);其中,何首烏飲組效果最好(P0.05)。6.2甲基化水平:與正常組比較,衰老組甲基化水平明顯降低(P0.05);何首烏飲組、淫羊藿苷組、松果菊苷組、齊墩果酸組和二苯乙烯苷組的甲基化百分比明顯高于衰老組(P0.05);其中,何首烏飲組效果最好(P0.05)。6.3組蛋白甲基化:與正常組相比較,衰老組C-myb啟動(dòng)子區(qū)域H3K9me3富集明顯增加(P0.05),而H3K27me3和H3K9me2富集差異不大(P0.05)。與衰老組比較,何首烏飲組、松果菊苷組、齊墩果酸組和二苯乙烯苷組C-myb啟動(dòng)子區(qū)域H3K9me3富集顯著降低(P0.05),淫羊藿苷組與衰老組無顯著性差異(P0.05)。齊墩果酸組H3K27me3富集明顯高于衰老組(P0.05),其余各組與衰老組之間差異不大(P0.05)。何首烏飲及單體化合物組與衰老組比較,H3K9me2富集無顯著性差異(P0.05)。7.何首烏飲及其單體化合物對(duì)MAPK10的甲基化調(diào)控作用7.1 mRNA表達(dá)水平:與正常組比較,衰老組表達(dá)水平明顯升高(P0.05);何首烏飲組、淫羊藿苷組,松果菊苷組、齊墩果酸組和二苯乙烯苷組表達(dá)水平明顯低于衰老組(P0.05);其中,何首烏飲組效果最好(P0.05)。7.2甲基化水平:與正常組比較,衰老組甲基化水平明顯降低(P0.05);何首烏飲組、淫羊藿苷組,松果菊苷組、齊墩果酸組和二苯乙烯苷組的甲基化百分比明顯高于衰老組(P0.05);其中,何首烏飲組效果最好(P0.05)。7.3組蛋白甲基化:MAPK10啟動(dòng)子區(qū)域未檢測到H3K27me3,H3K9me3和H3K9me2的富集。8.相關(guān)性分析AXL、wnt2b、MAPK10的表達(dá)水平和甲基化水平呈高度的負(fù)相關(guān)(P0.05);C-myb的表達(dá)水平和甲基化水平呈高度正相關(guān)(P0.05);Ttc29的表達(dá)水平和甲基化水平的相關(guān)系數(shù)沒有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:1.何首烏飲通過下調(diào)AXL、wnt2b、MAPK10和Ttc29基因mRNA水平,上調(diào)C-myb基因mRNA水平,延緩Leydig細(xì)胞衰老,且效果明顯優(yōu)于其他單體化合物組。2.何首烏飲通過上調(diào)AXL、wnt2b、MAPK10和C-myb的甲基化水平,下調(diào)Ttc29的甲基化水平,延緩Leydig細(xì)胞衰老,且效果明顯優(yōu)于其他單體化合物組。3.AXL、wnt2b、MAPK10的甲基化水平和mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān);C-myb的甲基化水平和mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān),Ttc29的甲基化水平和mRNA表達(dá)水平無相關(guān)性。何首烏飲通過調(diào)控基因的甲基化水平和mRNA表達(dá)水平抑制Leydig細(xì)胞衰老。4.何首烏飲通過上調(diào)H3K27me3的表達(dá),抑制wnt2b基因轉(zhuǎn)錄;同時(shí)可能通過下調(diào)H3K9me3的表達(dá),促進(jìn)C-myb基因轉(zhuǎn)錄,抑制Leydig細(xì)胞衰老過程,且效果明顯優(yōu)于其他單體化合物組。
【學(xué)位單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

老化過程中表觀遺傳變化的概述

可以與老化過程中總的及局部的 DNA 低甲基化同時(shí)發(fā)生，這可能是為了抑制某些特定基因的表達(dá)（圖2）。有分析表明順式作用元件的 DNA 甲基化缺失，如胰腺 B 細(xì)胞增強(qiáng)子區(qū)域，提示轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合可能降低 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別這些位點(diǎn)的能力，導(dǎo)致衰老細(xì)胞基因異常表達(dá)[30]。研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物某些 CpG 位點(diǎn)的甲基化水平與年齡之間呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，可以作為“表觀遺傳時(shí)鐘”，用于預(yù)測生物學(xué)年齡[31]。SIRT 家族脫乙酰酶可以影響衰老，主要是通過基因座，特異性調(diào)節(jié)衰老相關(guān)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和多種調(diào)節(jié)蛋白的活性。例如，哺乳動(dòng)物 Sirt1 通過調(diào)節(jié) DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1/3A/3B（Dnmt1/3A/3B）的活性能維持 DNA甲基化，調(diào)節(jié)表觀遺傳的改變[32]；Sirt7 通過募集 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1 和 Sirt1 介導(dǎo) rRNA基因的異染色質(zhì)形成，維持 rDNA 和基因組的穩(wěn)定性[33]。在老化過程中

圖 1 Leydig 細(xì)胞 3β-HSD 特異性染色（標(biāo)尺：A=100 μm，B=50 μm，C=20 μm）圖 2 正常組和衰老組 Leydig 細(xì)胞 β-半乳糖苷酶衰老染色（標(biāo)尺=100 μm）（A 正常組；B 衰老組）2.5 MTT 篩選單體化合物作用最適濃度（1）淫羊藿苷濃度篩選：濃度梯度設(shè)置為 10 μM、20 μM、40 μM、80 μM 和 160 μM，作用于培養(yǎng)了 48 h 的細(xì)胞。各濃度藥物在細(xì)胞中分別繼續(xù)作用 24 h、48 h 和 72 h 后，

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號(hào)：2831471