研究背景及目的:氧化應(yīng)激損傷是心血管疾病的一個(gè)重要的致病因素。缺血缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)。而活性氧在控制血管內(nèi)皮功能、血管張力以及誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、增殖、凋亡、遷移等病理生理過(guò)程中有著重要作用。鼠李素是具有較高的生物活性的黃酮類(lèi)化合物之一,其對(duì)心肌氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用,但是關(guān)于其發(fā)揮作用的分子生物學(xué)機(jī)制的研究較少,因此本研究的主要目的是采用RNA-Seq分析技術(shù)和多種生物信息學(xué)方法來(lái)揭示鼠李素保護(hù)心肌氧化應(yīng)激損傷的分子機(jī)制,為臨床治療提供新的作用靶點(diǎn)。方法:通過(guò)H_2O_2誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9C2,建立損傷模型。H_2O_2處理H9C2細(xì)胞作為對(duì)照組,H_2O_2處理+鼠李素給藥為處理組,提取RNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行以下分析:(1)篩選差異表達(dá)基因與構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)。采用NOISeq數(shù)據(jù)分析包計(jì)算差異表達(dá)基因,設(shè)置篩選條件為:P value0.05及|log2FC|2。基于Gene ontology數(shù)據(jù)庫(kù)以及KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能以及通路富集分析。基于String數(shù)據(jù)庫(kù)信息,建立蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò),設(shè)置條件:combined score不低于0.9�；贑ytosape插件MCODE進(jìn)行子網(wǎng)絡(luò)模塊挖掘,閾值設(shè)置:Degree Cut off=2,Node Score Cutoff=0.2,K-Core=2,Max.Depth=100。(2)差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)的深度挖掘�；趍iRWalk2.0工具檢索差異表達(dá)基因的調(diào)控miRNA,并利用R軟件包c(diǎn)lusterprofiler對(duì)miRNA進(jìn)行KEGG功能富集分析�；趍iRBase,miranda工具篩選score180的miRNA-lncRNA關(guān)系對(duì)。ceRNA以及miRNA-TF-gene網(wǎng)絡(luò)中差異基因的GO-BP功能和KEGG富集運(yùn)用DAVID工具來(lái)分析。運(yùn)用WebGestalt網(wǎng)站對(duì)差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)�；贒GIdb藥物預(yù)測(cè)受miRNA和TF調(diào)控的關(guān)鍵差異基因的Drug-gene互作關(guān)系對(duì)�；谲浖﨏ytoscape構(gòu)建miRNA-gene,miRNA-lncRNA,ceRNA,TF-gene,miRNA-TF-gene以及Drug-gene互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。(3)差異表達(dá)基因的qPCR驗(yàn)證。基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出的差異表達(dá)基因,篩選上調(diào)表達(dá)基因(NOTCH3,NUMBL,BCL2L11)和下調(diào)表達(dá)基因(PPP6C,MAPK1),通過(guò)qPCR方法檢測(cè)其在大鼠心肌細(xì)胞H9C2對(duì)照組(H_2O_2處理)和實(shí)驗(yàn)組(H_2O_2處理+鼠李素給藥)中的表達(dá)差異情況。結(jié)果:(1)通過(guò)比較對(duì)照組(H_2O_2處理)和實(shí)驗(yàn)組(H_2O_2處理+鼠李素給藥)的表達(dá)數(shù)據(jù),共獲得1452個(gè)差異表達(dá)基因,其中對(duì)應(yīng)上調(diào)和下調(diào)基因分別為703個(gè)和749個(gè)。GO功能富集分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因涉及的生物進(jìn)程主要包括細(xì)胞或大分子代謝、細(xì)胞周期或細(xì)胞分裂、代謝或信號(hào)通路的調(diào)控、信號(hào)通路等。KEGG通路富集分析主要涉及的關(guān)鍵信號(hào)通路包括細(xì)胞粘著連接,Notch信號(hào)通路、氧化磷酸化、蛋白水解等。PPI網(wǎng)絡(luò)共包括609個(gè)節(jié)點(diǎn),并得到了2個(gè)score6的子網(wǎng)絡(luò)模塊,其中模塊1涵蓋了17個(gè)節(jié)點(diǎn),并富集在mRNA降解、翻譯、蛋白質(zhì)定位相關(guān)的功能上;而模塊2涵蓋15個(gè)節(jié)點(diǎn),主要富集于細(xì)胞分裂過(guò)程相關(guān)功能上。(2)通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因做聚類(lèi)熱圖分析顯示,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異明顯。差異表達(dá)基因調(diào)控miRNA的預(yù)測(cè)共獲得189個(gè)miRNA以及577對(duì)miRNA-gene調(diào)控關(guān)系對(duì)。其中較為關(guān)鍵的miRNA主要包括miRNA-349,miR-211-5p以及miR-17-5p等。KEGG通路富集顯示預(yù)測(cè)得到的miRNA顯著富集到75個(gè)通路中,其中AMPK及PI3K-Akt信號(hào)通路富集的miRNA最多。通過(guò)對(duì)miRNA-gene調(diào)控關(guān)系作圖,共獲得120個(gè)節(jié)點(diǎn)和216個(gè)互作關(guān)系對(duì)。基于已有的miRNA對(duì)其調(diào)控的lncRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)共獲得475個(gè)miRNA-lncRNA關(guān)系對(duì)。ceRNA網(wǎng)絡(luò)中共有74個(gè)miRNA,90個(gè)mRNA以及60個(gè)lncRNA,其GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,主要涉及的生物學(xué)過(guò)程包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(GO:0045944),凋亡負(fù)調(diào)節(jié)過(guò)程(GO:0043066)以及轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(GO:004589)等過(guò)程;主要涉及的關(guān)鍵信號(hào)通路包括腎上腺素以及Notch等信號(hào)通路。此外,對(duì)差異表達(dá)基因相關(guān)的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè),共獲得9個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(PAX4,ELK1,ETS2,NRF1,GABP,E4F1,CACBINDINGPROTEIN,AP2ALPHA以及AP2GAMMA)。進(jìn)一步地,通過(guò)構(gòu)建miRNA-TF-gene調(diào)控網(wǎng)絡(luò)整合得到241個(gè)調(diào)控關(guān)系對(duì),且功能富集和通路富集分別富集到145個(gè)GO-BP結(jié)果和52個(gè)KEGG通路,富集結(jié)果與ceRNA網(wǎng)絡(luò)基本一致。最后,我們對(duì)drug-gene互作關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),結(jié)合富集生物學(xué)過(guò)程分析的與藥物反應(yīng)相關(guān)的基因分析發(fā)現(xiàn)基因BCL2L1,DNMT3A,HDAC2,STAT3等基因?yàn)橹匾乃幬镄》肿踊颉?3)qPCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比鼠李素處理組中的NOTCH3、MAPK1基因表達(dá)水平顯著性下調(diào)(P0.05),BCL2L11基因表達(dá)顯著性上調(diào)(P0.05),而上調(diào)基因BCL2L11與下調(diào)基因MAPK1表達(dá)趨勢(shì)與前期預(yù)測(cè)結(jié)果相符,但差異不顯著(P0.05)。結(jié)論:總的來(lái)說(shuō),本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)鼠李素對(duì)心肌氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)心肌細(xì)胞鼠李素處理組以及對(duì)照組分析獲得關(guān)鍵差異表達(dá)基因包括COX6A2,NDUFA2,UBA52,CDK1,MAPK1,Klf9以及NAA15;重要的miRNA包括miR-211-5p以及miR-17-5p;重要的轉(zhuǎn)錄因子包括ELK1及PAX4等;重要的信號(hào)通路包括Notch,AMPK以及PI3K/Akt信號(hào)通路;重要的藥物小分子基因包括BCL2L1,DNMT3A,HDAC2以及STAT3。同時(shí),該研究構(gòu)建了一系列調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,系統(tǒng)闡述了鼠李素對(duì)心肌氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用過(guò)程中不同作用因子之間的相互作用關(guān)系,這也將為今后的研究提供重要的依據(jù)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R285
【部分圖文】：

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的流程圖

第 2 章 使用 RNA-seq 數(shù)據(jù)分析鼠李素在心肌氧化應(yīng)激損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制果NA 質(zhì)量控制瓊脂糖凝膠電泳組和對(duì)照組的細(xì)胞進(jìn)行總 RNA 提取，后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn) 18S、28S 條帶清晰，且亮度比為 28S: 18S，約為 2: 1。這說(shuō)明 濃度較高，無(wú)明顯的降解，可用于構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)進(jìn)行 RNAseq 分

測(cè)序結(jié)果堿基組成情況

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