目的:考察丹參注射液對體外培養(yǎng)的原代人軟骨細胞和成骨細胞的生物效應,探討其治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松的作用機理。方法:以丹參注射液丹參生藥(1.5 mg· mL-1)作為計算藥物濃度。軟骨細胞藥物分組:對照組、0.5、1.0、2.0、4.0 mg· mL-1。成骨細胞藥物分組:對照組、0.5、1.0、2.0、3.0 mg ·mL-1。用指示細胞培養(yǎng)法(DNA染色法)檢測人原代軟骨細胞和成骨細胞是否有支原體污染;用RT-PCR法檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原基因的表達鑒定軟骨細胞;用ALP活性檢測和茜素紅染色法染色鈣結(jié)節(jié)鑒定成骨細胞;用MTT(Methylthiazole tetrazolium)法評價原代人關(guān)節(jié)軟骨細胞(第3代)和成骨細胞hFOB1.19增殖活性;用熒光定量RT-PCR法測定軟骨細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原基因的表達量,成骨細胞BMP-2、Runx2、OCN、COL1A1、BSP基因的表達量;用酶聯(lián)免疫方法檢測軟骨細胞I、II型膠原的含量,成骨細胞I型膠原、OPN、OCN含量;用糖胺多糖試劑盒法檢測軟骨細胞總糖胺多糖的含量,評價軟骨細胞的功能蛋白水平;用堿性磷酸酶試劑盒法檢測成骨細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性。結(jié)果:1、支原體檢測和細胞鑒定:結(jié)果顯示,支原體陽性對照和陰性對照試驗結(jié)果有效,人原代關(guān)節(jié)軟骨細胞和成骨細胞無支原體檢出;細胞檢測出Ⅰ、Ⅱ型膠原基因的表達,說明細胞為軟骨細胞。成骨細胞檢測到ALP以及出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié),說明細胞hFOB1.19具有成骨能力。2、軟骨細胞生物效應研究:MTT實驗結(jié)果顯示,各濃度丹參注射液組的細胞相對活性均低于對照組,且降低趨勢有量-效關(guān)系,提示丹參注射液對原代人關(guān)節(jié)軟骨細胞有生長抑制效應;熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示,各濃度組細胞I型膠原mRNA表達量均低于對照組,且有一定的量-效關(guān)系;I型膠原蛋白檢測結(jié)果顯示,低劑量(≤2.0 mg ·mL-1)組可顯著抑制I型膠原表達。這些結(jié)果提示低劑量的丹參注射液可能對原代人關(guān)節(jié)軟骨細胞的脫分化有一定的抑制作用。同時,低劑量丹參注射液(≤4.0 mg ·mL-1)能促進糖胺多糖的含量增加,提示低劑量丹參注射液有促進軟骨形成的生物效應。3、成骨細胞生物效應研究:MTT結(jié)果顯示,4.0、6.0、8.0、10.0 mg· mL-1濃度的丹參注射液的成骨細胞相對活性均低于對照組,且降低趨勢有量-效關(guān)系。低劑量(4.0 mg·mL-1 組對成骨細胞增殖無影響;熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示,給藥3 天時,2.0mg·mL-1 組上調(diào)了 BMP-2、Runx2、OCN、COL1A1、BSPmRNA 的表達。給藥7天時,對各基因表達與對照組相比沒有顯著性差異;堿性磷酸酶結(jié)果顯示,作用3天時,各濃度組均可促進堿性磷酸酶活性,作用7天時,對堿性磷酸酶活性與對照組相比沒有顯著性差異;ELISA檢測結(jié)果顯示,作用3天時,2.0 mg ·mL-1組可促進[型膠原蛋白含量,2.0、3.0 mg· mL-1組可促進OCN含量,0.5、1.0、2.0 mg·mL-1組OPN含量與對照組相比無顯著性差異。結(jié)論:1、人原代關(guān)節(jié)軟骨細胞和成骨細胞hFOB1.19沒有支原體污染。細胞分別鑒定為軟骨細胞和成骨細胞。2、低劑量的丹參注射液可輕微抑制人第3代關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖,抑制I型膠原(脫分化指標)的形成和促進糖胺多糖的合成,提示其具有促進軟骨形成的生物效應。3、在不影響成骨細胞增殖的情況下,一定濃度丹參注射液可促進BMP-2、Runx2、OCN、COL1A1、BSPmRNA的表達,及堿性磷酸酶活性、I型膠原蛋白、OCN含量。提示其具有促進成骨細胞分化和誘導成骨效應。
【學位單位】：福建中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
英文縮略詞表
中文摘要
Abstract
前言
第一章 細胞質(zhì)量評價
    第一節(jié) 細胞支原體檢測
        1 材料與儀器
            1.1 試劑和材料
            1.2 儀器設備
        2 方法
            2.1 樣品及試劑的制備
            2.2 指示細胞的制備
            2.3 接種
            2.4 染色及檢測
        3 結(jié)果
        4 結(jié)論
    第二節(jié) 軟骨細胞和成骨細胞鑒定
        1 材料與儀器
            1.1 材料與試劑
            1.2 儀器
        2 方法
            2.1 原代人關(guān)節(jié)軟骨細胞分離和培養(yǎng)
            2.2 RT-PCR檢測軟骨細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原基因
            2.3 人成骨細胞培養(yǎng)
            2.4 成骨細胞鈣結(jié)節(jié)染色
            2.5 成骨細胞堿性磷酸酶檢測
        3 結(jié)果
            3.1 軟骨細胞形態(tài)
            3.2 軟骨細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原mRNA檢測
            3.3 鈣結(jié)節(jié)染色
            3.4 ALP檢測
        4 結(jié)論
第二章 丹參注射液體外對原代人軟骨細胞的生物效應實驗研究
    1 材料與儀器
        1.1 材料
        1.2 儀器
    2 方法
        2.1 MTT實驗
        2.2 熒光定量RT-PCR
        2.3 ELISA方法檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量
        2.4 糖胺多糖的檢測
        2.5 統(tǒng)計學分析
    3 結(jié)果
        3.1 對軟骨細胞增殖的影響
        3.2 mRNA表達水平
        3.3 丹參注射液對Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量的影響
        3.4 丹參注射液對糖胺多糖含量的影響
    4 討論
第三章 丹參注射液體外對人成骨細胞的生物效應實驗研究
    1 材料與儀器
        1.1 試劑
        1.2 儀器
    2 方法
        2.1 MTT實驗
        2.2 堿性磷酸酶檢測
        2.3 qRT-PCR檢測細胞各指標mRNA
        2.4 ELISA方法檢測各指標的含量
        2.5 統(tǒng)計學分析
    3 結(jié)果
        3.1 不同濃度SMI對成骨細胞增殖影響
        3.2 實驗成骨細胞ALP含量
        3.3 qRT-PCR檢測各指標的熔解曲線
        3.4 qRT-PCR檢測各指標的擴增曲線
        3.5 qRT-PCR檢測各指標mRNA表達量
        3.6 ELISA法檢測Ⅰ型膠原、OPN、OCN含量
    4 討論和結(jié)論
第四章 全文總結(jié)和展望
    1 總結(jié)
    2 展望
參考文獻
文獻綜述
    參考文獻
致謝
作者簡歷

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