目的:利用Transwell共培養(yǎng)板,建立脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)體系,分析檢測(cè)茶多酚的抗炎作用,并從AMPK信號(hào)通路探討其抗炎作用機(jī)制。方法:1處理與分組:建立4個(gè)處理組,分別為成熟脂肪細(xì)胞組(N組)、TNF-α處理組(T組)、巨噬-脂肪細(xì)胞共同培養(yǎng)組(R組)和LPS誘導(dǎo)過(guò)的巨噬細(xì)胞-脂肪細(xì)胞共同培養(yǎng)組(L組)。成熟脂肪細(xì)胞組是將前體脂肪細(xì)胞加入0.5 mmol/L IBMX、1μmol/L DEX和10μg/mL Inslulin等誘導(dǎo)劑誘導(dǎo),48 h后,添加只含有10μg/mL Inslulin的胎牛培養(yǎng)基誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞成熟分化,脂肪細(xì)胞分化成熟后,即可分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚;TNF-α處理組,是在成熟脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)上,每孔添加10 ng/mL的TNF-α24h后分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚;巨噬-脂肪細(xì)胞共同培養(yǎng)組,是將分化成熟的脂肪細(xì)胞與巨噬細(xì)胞在Transwell共同培養(yǎng)板中共同培養(yǎng)24h后,分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚;LPS誘導(dǎo)過(guò)的巨噬細(xì)胞-脂肪細(xì)胞共同培養(yǎng)組,是將分化成熟的脂肪細(xì)胞與經(jīng)LPS脂多糖誘導(dǎo)過(guò)的巨噬細(xì)胞在Transwell共同培養(yǎng)板中共同培養(yǎng)24h后,分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚。2各處理分組添加不同濃度茶多酚48h后,每孔加入RNA提取試劑盒中的裂解液1000μl充分裂解后,將裂解后的細(xì)胞收集到事先標(biāo)號(hào)的無(wú)RNA酶的EP管中,采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)各處理組中脂肪細(xì)胞的促炎性因子、抗炎性因子及炎性酶的基因表達(dá)水平。3細(xì)胞分化成熟后加入200μl含有2μl蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物的PIPA裂解液,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)各組脂肪細(xì)胞的AMPK、Sirt1、NF-кB(p65)、Foxo3a、P53(THr172)及C-JUN(S73)相關(guān)信號(hào)通路的磷酸化水平。結(jié)果:1與N0組相比,T0組、R0組和L0組的IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12及COX-2和iNOS兩種炎性酶的基因表達(dá)量顯著上升(p0.05)。添加不同濃度茶多酚之后,促炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12及COX-2和iNOS兩種炎性酶的基因表達(dá)量顯著下降(p0.05)且隨茶多酚濃度的增加基因表達(dá)量下降更明顯,有明顯的劑量關(guān)系,說(shuō)明茶多酚可以抑制T組的促炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12及COX-2和iNOS兩種炎性酶的表達(dá),從而抑制炎癥反應(yīng),這種抑制作用隨茶多酚濃度的升高而增強(qiáng)。2 N0組的IL-4和IL-10基因表達(dá)量很高,T0組、R0組和L0組與N0組相比,IL-4和IL-10基因的表達(dá)量降低(p0.05)。添加不同濃度茶多酚之后IL-4和IL-10的基因表達(dá)量顯著上升(p0.05),且隨濃度的增加上升更為明顯。3 T0組、R0組和L0組與N0組相比各靶點(diǎn)磷酸化表達(dá)被明顯抑制;N50、N100與N0組相比,AMPK磷酸化表達(dá)增強(qiáng),且N100比N50效果明顯;T50、T100與T0組相比,AMPK、Sirt1、NF-κB(p65)、Foxo3a、P53和C-JUN磷酸化表達(dá)被抑制,添加茶多酚之后,AMPK、Sirt1、NF-κB(p65)、Foxo3a、P53和C-JUN磷酸化表達(dá)明顯上升,且T100比T50效果更為明顯;R50、R100與R0組相比,R50、R100組AMPK磷酸化表達(dá)比R0組高,且R100比R50效果更明顯;L50、L100與L0組相比,L50、L100組AMPK磷酸化表達(dá)上調(diào),且L100組比L50組上調(diào)明顯。只有各靶點(diǎn)磷酸化表達(dá)被抑制,組間總蛋白無(wú)差異。結(jié)論:茶多酚對(duì)炎癥有一定的抵御作用,可以通過(guò)AMPK/Sirt1途徑發(fā)揮抗炎作用,通過(guò)降低相關(guān)促炎性因子的基因表達(dá)及升高抗炎性因子的基因表達(dá)發(fā)揮作用,且隨茶多酚濃度的增加抗炎作用增強(qiáng);巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS脂多糖誘導(dǎo)過(guò)后,可以更好的刺激脂肪細(xì)胞分泌促炎性因子。
【學(xué)位單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

以巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系研究茶多酚的抗炎作用機(jī)制SIRT1 激活后，SIRT1 導(dǎo)致 LKB1 的未乙酰化，促進(jìn)它進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)及其活化，導(dǎo)致 AMPK 的磷酸化和激活[64]。 敲低 SIRT1 導(dǎo)致 AMPK 激活減少，AMPK 激活劑白藜蘆醇因其抑制作用需要 SIRT1 和 LKB1 的存在[65]。AMPK 也可激活正反饋環(huán)中的SIRT1[66]。在熱量限制時(shí) NAD+可能會(huì)增加，最可能通過(guò)減少糖酵解和增強(qiáng)來(lái)自存儲(chǔ)脂肪酸的 B 氧化的氧化磷酸化[67]，將通過(guò) SIRT1 導(dǎo)致 AMPK 激活，從而有助于抗炎作用[68]。 如圖 1 中示出。

3T3-L1 前脂肪細(xì)胞 3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞圖 2 3T3-L1 脂肪細(xì)胞的分化Figure.2 3T3-L1 adipocytes differentiation同濃度 TP 對(duì)脂肪細(xì)胞中 IL-1α基因表達(dá)的影響細(xì)胞介素 1（IL-1）是由許多類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（包括骨細(xì)胞）產(chǎn)生。 進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，并參與炎癥和傷口愈合。IL-1 主要是由活化的單核-巨噬和分泌的一種細(xì)胞因子，IL-1 由 IL-1α和 IL-1β構(gòu)成，酸性的 IL-1 稱為 ILIL-1 稱為 IL-1β[87]。IL-1α在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。IL-1 可以細(xì)胞、參與抗體產(chǎn)生、促炎癥反應(yīng)和協(xié)同刺激胸腺細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)激素樣作同樣是促炎性因子作為前炎癥中的一級(jí)因子，對(duì)炎癥的發(fā)生起著重要的作能夠改變血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞等外核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)，加重炎癥反應(yīng)。TNF-α同時(shí)還是與炎癥嚴(yán)重程度有

以巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系研究茶多酚的抗炎作用機(jī)制相比，IL-1α的基因表達(dá)量并無(wú)差異性；T50、T100 與 T0 組相比，添加茶多，IL-1α的基因表達(dá)量明顯下降（p<0.05）且 T100 比 T50 基因表達(dá)量下降明顯茶多酚可以抑制T組IL-1α的表達(dá)從而抑制炎癥反應(yīng)且隨濃度的升高而增強(qiáng)；R 與 R0 組相比，R50、R100 組 IL-1α的基因表達(dá)量比 R0 組低（p<0.05），且 R1 R50 組 IL-1α的基因表達(dá)量更低，說(shuō)明茶多酚可抑制 R 組 IL-1α的表達(dá)且呈現(xiàn)系。L50、L100與L0組相比，L50、L100組IL-1α的基因表達(dá)量比L0組低（p<0.0500 組比 L50 組 IL-1α的基因表達(dá)量更低，說(shuō)明茶多酚可抑制 L 組 IL-1α的表達(dá)量效關(guān)系。

【參考文獻(xiàn)】

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1 袁建國(guó);周明明;蔣正英;李蕊;;IL-10聯(lián)合生長(zhǎng)抑素對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的抑制作用[J];醫(yī)學(xué)綜述;2014年23期

2 趙軍;趙美琴;史長(zhǎng)征;陳紅輝;;基于SIRT1軸探討不同強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD大鼠脂肪性肝炎的影響[J];體育科學(xué);2014年11期

3 張曉明;林玲;艾青;張力;;Sirtuin1:抗炎治療新靶點(diǎn)[J];生命的化學(xué);2014年02期

4 代潔;張曉明;林玲;艾青;張力;;能量敏感的AMPK-SIRT1通路與炎癥調(diào)控[J];生命科學(xué);2014年04期

5 胡陽(yáng)黔;李靜;劉堅(jiān);歐陽(yáng)靜萍;宋杰;;黃芪多糖通過(guò)活化AMPK和促進(jìn)骨骼肌FAT/CD36轉(zhuǎn)位改善成肌細(xì)胞FFAs代謝[J];中國(guó)病理生理雜志;2013年04期

6 張曉夢(mèng);倪艷;李先榮;;茶多酚的藥理作用研究進(jìn)展[J];藥物評(píng)價(jià)研究;2013年02期

7 姚烽;汲廣巖;張力;;腺苷酸活化蛋白激酶:炎癥調(diào)控新靶點(diǎn)[J];生理學(xué)報(bào);2012年03期

8 史記;孟愛(ài)民;侯琦;;沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶與肺部疾病[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2012年04期

9 王毅群;董怡;涂治才;姚明輝;;吡啶羧酸鉻通過(guò)AMPK信號(hào)通路促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36的轉(zhuǎn)位[J];中國(guó)臨床藥學(xué)雜志;2011年04期

10 鄔新榮;王岳飛;張士康;徐平;楊賢強(qiáng);;茶多酚保健功能研究進(jìn)展與保健食品開(kāi)發(fā)[J];茶葉科學(xué);2010年S1期

本文編號(hào)：2830588