目的:利用Transwell共培養(yǎng)板,建立脂肪細胞和巨噬細胞共同培養(yǎng)體系,分析檢測茶多酚的抗炎作用,并從AMPK信號通路探討其抗炎作用機制。方法:1處理與分組:建立4個處理組,分別為成熟脂肪細胞組(N組)、TNF-α處理組(T組)、巨噬-脂肪細胞共同培養(yǎng)組(R組)和LPS誘導過的巨噬細胞-脂肪細胞共同培養(yǎng)組(L組)。成熟脂肪細胞組是將前體脂肪細胞加入0.5 mmol/L IBMX、1μmol/L DEX和10μg/mL Inslulin等誘導劑誘導,48 h后,添加只含有10μg/mL Inslulin的胎牛培養(yǎng)基誘導前體脂肪細胞成熟分化,脂肪細胞分化成熟后,即可分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚;TNF-α處理組,是在成熟脂肪細胞基礎上,每孔添加10 ng/mL的TNF-α24h后分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚;巨噬-脂肪細胞共同培養(yǎng)組,是將分化成熟的脂肪細胞與巨噬細胞在Transwell共同培養(yǎng)板中共同培養(yǎng)24h后,分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚;LPS誘導過的巨噬細胞-脂肪細胞共同培養(yǎng)組,是將分化成熟的脂肪細胞與經(jīng)LPS脂多糖誘導過的巨噬細胞在Transwell共同培養(yǎng)板中共同培養(yǎng)24h后,分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚。2各處理分組添加不同濃度茶多酚48h后,每孔加入RNA提取試劑盒中的裂解液1000μl充分裂解后,將裂解后的細胞收集到事先標號的無RNA酶的EP管中,采用熒光定量PCR的方法檢測各處理組中脂肪細胞的促炎性因子、抗炎性因子及炎性酶的基因表達水平。3細胞分化成熟后加入200μl含有2μl蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物的PIPA裂解液,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組脂肪細胞的AMPK、Sirt1、NF-кB(p65)、Foxo3a、P53(THr172)及C-JUN(S73)相關信號通路的磷酸化水平。結(jié)果:1與N0組相比,T0組、R0組和L0組的IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12及COX-2和iNOS兩種炎性酶的基因表達量顯著上升(p0.05)。添加不同濃度茶多酚之后,促炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12及COX-2和iNOS兩種炎性酶的基因表達量顯著下降(p0.05)且隨茶多酚濃度的增加基因表達量下降更明顯,有明顯的劑量關系,說明茶多酚可以抑制T組的促炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12及COX-2和iNOS兩種炎性酶的表達,從而抑制炎癥反應,這種抑制作用隨茶多酚濃度的升高而增強。2 N0組的IL-4和IL-10基因表達量很高,T0組、R0組和L0組與N0組相比,IL-4和IL-10基因的表達量降低(p0.05)。添加不同濃度茶多酚之后IL-4和IL-10的基因表達量顯著上升(p0.05),且隨濃度的增加上升更為明顯。3 T0組、R0組和L0組與N0組相比各靶點磷酸化表達被明顯抑制;N50、N100與N0組相比,AMPK磷酸化表達增強,且N100比N50效果明顯;T50、T100與T0組相比,AMPK、Sirt1、NF-κB(p65)、Foxo3a、P53和C-JUN磷酸化表達被抑制,添加茶多酚之后,AMPK、Sirt1、NF-κB(p65)、Foxo3a、P53和C-JUN磷酸化表達明顯上升,且T100比T50效果更為明顯;R50、R100與R0組相比,R50、R100組AMPK磷酸化表達比R0組高,且R100比R50效果更明顯;L50、L100與L0組相比,L50、L100組AMPK磷酸化表達上調(diào),且L100組比L50組上調(diào)明顯。只有各靶點磷酸化表達被抑制,組間總蛋白無差異。結(jié)論:茶多酚對炎癥有一定的抵御作用,可以通過AMPK/Sirt1途徑發(fā)揮抗炎作用,通過降低相關促炎性因子的基因表達及升高抗炎性因子的基因表達發(fā)揮作用,且隨茶多酚濃度的增加抗炎作用增強;巨噬細胞經(jīng)LPS脂多糖誘導過后,可以更好的刺激脂肪細胞分泌促炎性因子。
【學位單位】：山東中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

以巨噬-脂肪細胞共培養(yǎng)體系研究茶多酚的抗炎作用機制SIRT1 激活后，SIRT1 導致 LKB1 的未乙�；龠M它進入細胞質(zhì)及其活化，導致 AMPK 的磷酸化和激活[64]。 敲低 SIRT1 導致 AMPK 激活減少，AMPK 激活劑白藜蘆醇因其抑制作用需要 SIRT1 和 LKB1 的存在[65]。AMPK 也可激活正反饋環(huán)中的SIRT1[66]。在熱量限制時 NAD+可能會增加，最可能通過減少糖酵解和增強來自存儲脂肪酸的 B 氧化的氧化磷酸化[67]，將通過 SIRT1 導致 AMPK 激活，從而有助于抗炎作用[68]。 如圖 1 中示出。

3T3-L1 前脂肪細胞 3T3-L1 成熟脂肪細胞圖 2 3T3-L1 脂肪細胞的分化Figure.2 3T3-L1 adipocytes differentiation同濃度 TP 對脂肪細胞中 IL-1α基因表達的影響細胞介素 1（IL-1）是由許多類型的哺乳動物細胞（包括骨細胞）產(chǎn)生。 進淋巴細胞增殖，并參與炎癥和傷口愈合。IL-1 主要是由活化的單核-巨噬和分泌的一種細胞因子，IL-1 由 IL-1α和 IL-1β構成，酸性的 IL-1 稱為 ILIL-1 稱為 IL-1β[87]。IL-1α在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。IL-1 可以細胞、參與抗體產(chǎn)生、促炎癥反應和協(xié)同刺激胸腺細胞增殖，呈現(xiàn)激素樣作同樣是促炎性因子作為前炎癥中的一級因子，對炎癥的發(fā)生起著重要的作能夠改變血管內(nèi)皮細胞的通透性，導致白細胞、淋巴細胞及單核細胞等外核細胞趨化蛋白(MCP)，加重炎癥反應。TNF-α同時還是與炎癥嚴重程度有

以巨噬-脂肪細胞共培養(yǎng)體系研究茶多酚的抗炎作用機制相比，IL-1α的基因表達量并無差異性；T50、T100 與 T0 組相比，添加茶多，IL-1α的基因表達量明顯下降（p<0.05）且 T100 比 T50 基因表達量下降明顯茶多酚可以抑制T組IL-1α的表達從而抑制炎癥反應且隨濃度的升高而增強；R 與 R0 組相比，R50、R100 組 IL-1α的基因表達量比 R0 組低（p<0.05），且 R1 R50 組 IL-1α的基因表達量更低，說明茶多酚可抑制 R 組 IL-1α的表達且呈現(xiàn)系。L50、L100與L0組相比，L50、L100組IL-1α的基因表達量比L0組低（p<0.0500 組比 L50 組 IL-1α的基因表達量更低，說明茶多酚可抑制 L 組 IL-1α的表達量效關系。

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 袁建國;周明明;蔣正英;李蕊;;IL-10聯(lián)合生長抑素對大鼠重癥急性胰腺炎炎癥相關細胞因子的抑制作用[J];醫(yī)學綜述;2014年23期

2 趙軍;趙美琴;史長征;陳紅輝;;基于SIRT1軸探討不同強度有氧運動對NAFLD大鼠脂肪性肝炎的影響[J];體育科學;2014年11期

3 張曉明;林玲;艾青;張力;;Sirtuin1:抗炎治療新靶點[J];生命的化學;2014年02期

4 代潔;張曉明;林玲;艾青;張力;;能量敏感的AMPK-SIRT1通路與炎癥調(diào)控[J];生命科學;2014年04期

5 胡陽黔;李靜;劉堅;歐陽靜萍;宋杰;;黃芪多糖通過活化AMPK和促進骨骼肌FAT/CD36轉(zhuǎn)位改善成肌細胞FFAs代謝[J];中國病理生理雜志;2013年04期

6 張曉夢;倪艷;李先榮;;茶多酚的藥理作用研究進展[J];藥物評價研究;2013年02期

7 姚烽;汲廣巖;張力;;腺苷酸活化蛋白激酶:炎癥調(diào)控新靶點[J];生理學報;2012年03期

8 史記;孟愛民;侯琦;;沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關酶與肺部疾病[J];藥學學報;2012年04期

9 王毅群;董怡;涂治才;姚明輝;;吡啶羧酸鉻通過AMPK信號通路促進3T3-L1脂肪細胞脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36的轉(zhuǎn)位[J];中國臨床藥學雜志;2011年04期

10 鄔新榮;王岳飛;張士康;徐平;楊賢強;;茶多酚保健功能研究進展與保健食品開發(fā)[J];茶葉科學;2010年S1期

本文編號：2830588