目的:探討白果內(nèi)酯(Bilabolide,BB)的抗炎、免疫調(diào)節(jié)和髓鞘保護(hù)功效。方法:1.C57BL/6雌性小鼠經(jīng)四點(diǎn)法皮下注射MOG誘導(dǎo)建立EAE模型,免疫后第三天給予BB腹腔注射給藥至免疫后27天,記錄臨床評(píng)分。第28天處死小鼠,無菌取脾并分離脾單個(gè)淋巴細(xì)胞用于觀察外周免疫反應(yīng),取脊髓觀察中樞髓鞘病理變化。采用HE、LFB染色觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失情況,免疫熒光染色觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其表型變化;ELISA觀察脊髓組織和外周淋巴細(xì)胞促炎/抗炎細(xì)胞因子INF-γ、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-6、IL-l0和TGF-β表達(dá);Western blot觀察脾單個(gè)核淋巴細(xì)胞和脊髓iNOS、Arg-1、TLR4、MyD88、NF-κB、Bax、Cleave-Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)。2.運(yùn)用LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型,經(jīng)BB干預(yù)后,MTT/CCK-8法觀察細(xì)胞活力,ELISA觀察炎性細(xì)胞因子NO、TNF-α和IL-1β的表達(dá)。3.C57BL/6雌性小鼠四點(diǎn)法皮下注射MOG肽,免疫9天后處死,無菌取脾并分離脾單個(gè)核細(xì)胞與MOG_(35-55)體外共培養(yǎng)。隨后給予BB干預(yù),培養(yǎng)48小時(shí)后經(jīng)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,收集細(xì)胞和細(xì)胞液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ELISA測(cè)定培養(yǎng)液中促炎/抗炎細(xì)胞因子INF-γ、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β的分泌情況,Western blot觀察TLR4、MyD88和NF-κB的表達(dá)。結(jié)果:1.與EAE組相比,BB減輕了EAE小鼠疾病嚴(yán)重程度,延緩了EAE小鼠起病時(shí)間,EAE組為11.000±0.436天,BB20mg/kg組為13.710±0.738天,兩組比較p0.01。HE和LFB染色顯示,EAE小鼠脊髓炎細(xì)胞浸潤(rùn)量為1367±173.800,髓鞘累計(jì)光密度為64053±6529;BB20mg/kg組分別為176.500±49.870和80013±10470,兩組比較差異顯著,p值分別小于0.001和0.01,這表明BB減少了脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失。2.EAE小鼠脊髓浸潤(rùn)大量的CD4~+T細(xì)胞(147.300±33.500)和CD68~+巨噬細(xì)胞(1226±160),而BB治療組小鼠脊髓浸潤(rùn)的CD4~+T細(xì)胞(32.670±8.838)和CD68~+巨噬細(xì)胞(139.500±18.860)顯著減少,p值分別小于0.001和0.01;與EAE組相比,BB抑制了MOG誘導(dǎo)的外周淋巴細(xì)胞的活化與增殖(p0.001);抑制了外周淋巴細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,INF-γ(p0.001)、TNF-α(p0.001)、IL-17(p0.05)、IL-6(p0.05)和iNOS(p0.05),提高了抗炎細(xì)胞因子IL-10和Arg-1的表達(dá)(p0.001)3.BB抑制了EAE小鼠TLR-NF-κB炎性信號(hào)通路。EAE組TLR-4的相對(duì)表達(dá)量為0.788±0.095,MyD88為0.377±0.024,p-NF-κB為0.265±0.028;相應(yīng)的BB治療組分別為0.542±0.096、0.148±0.027和0.081±0.012,兩組比較p值均小于0.01。BB也降低了炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)(p0.05);同時(shí),促進(jìn)了抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的表達(dá)(p0.05)。4.BB促進(jìn)了活化的小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化。與EAE組相比,BB顯著抑制iNOS的表達(dá)(p0.001),同時(shí)顯著上調(diào)了Arg-1的表達(dá)(p0.05)。EAE組Iba-1~+iNOS~+細(xì)胞數(shù)為55.670±5.783,BB治療組為28±2.082,兩組比較p0.01;EAE組Iba-1~+Arg-1~+細(xì)胞數(shù)為22.330±4.702,BB治療組為40.330±6.333,兩組比較p0.05。5.BB減少了LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子NO、TNF-α和IL-1β的釋放(p0.05)。與LPS組相比,BB20μg/ml顯著促進(jìn)了LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖(p0.05)6.BB抑制了凋亡蛋白Bax、Cleave-Caspase-3的產(chǎn)生(p0.01),但提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)(p0.05)。EAE組CD4~+C-Caspase-3~+細(xì)胞數(shù)為95.670±12.440,BB治療組為8.667±2.028,兩組比較p0.001;BB通過抑制凋亡蛋白,上調(diào)抗凋亡蛋白,顯著促進(jìn)了CNPase~+少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活(p0.01)。7.BB抑制了致腦炎淋巴細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。與EAE組相比,BB壓制了MOG特異性致腦炎淋巴細(xì)胞的增殖(p0.05);抑制了炎性細(xì)胞因子NO、INF-γ、IL-1β、IL-6和IL-17的表達(dá)(p0.05);抑制了TLR-NF-κB炎性信號(hào)通路。結(jié)論:BB能夠有效緩解EAE小鼠的臨床癥狀,減少髓鞘的脫失。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),BB的治療作用與抑制TLR-NF-κB炎性信號(hào)通路有關(guān),表現(xiàn)為BB抑制炎性反應(yīng)(下調(diào)促炎細(xì)胞因子和上調(diào)抗炎細(xì)胞因子)、抑制MOG特異性淋巴細(xì)胞增殖,以及調(diào)節(jié)外周免疫反應(yīng)、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化及調(diào)節(jié)其表型向抗炎的M2型極化,抑制凋亡蛋白產(chǎn)生等。
【學(xué)位單位】：山西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R-332;R285.5
【部分圖文】：

改善了 EAE 小鼠的病情。由于 EAE 組與 BB（10 mg/kg）治療組之間不存在數(shù)據(jù)上的差異，因此在接下來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，選擇給藥劑量為 20mg/kg 的 BB 治療組繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過組織病理學(xué)分析（圖1b和1c），EAE組小鼠脊髓炎細(xì)胞浸潤(rùn)量為1367±173.800，BB 治療組為 176.500±49.870，兩組比較 p<0.001；EAE 組小鼠髓鞘累計(jì)光密度為64053±6529，BB 治療組為 80013±10470，兩組比較 p<0.01。這表明 BB 顯著抑制了炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)了髓鞘。

13圖 2 BB 改善了脊髓炎癥損傷）脊髓的切片用 anti-CD4 和 anti-CD-68 抗體孵育，CD68+巨噬細(xì)胞和 CD4+T 細(xì)胞代表性兩個(gè)研究員在熒光顯微鏡下觀察并拍攝，每組 3 只小鼠，比例尺為 50μm；脊髓模式圖于圖示的免疫熒光染色區(qū)域。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從各組所有小鼠的脾臟分離單個(gè)核淋巴細(xì)胞G35-55或不加 MOG35-55孵育脾單個(gè)核淋巴細(xì)胞。（b）細(xì)胞活力測(cè)定采用 CCK-8 法。統(tǒng)計(jì)雙因素方差分析，然后進(jìn)行 Bonferroni 檢驗(yàn)。（c） ELISA 法檢測(cè)相關(guān)的細(xì)胞因子。統(tǒng)用單因素方差分析，然后進(jìn)行 Tukey - Kramer 檢驗(yàn)（。d）脾臟 MNCs 裂解產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-，免疫印跡數(shù)據(jù)顯示各組 iNOS 和 Arg-1 蛋白水平。數(shù)據(jù)表示為平均值±S.E.M（*p < 0.05.001 vs. EAE 組）。

3.3 BB 抑制 CNS 的炎癥反應(yīng)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的一個(gè)重要效應(yīng)細(xì)胞，可以分泌促炎和抗炎細(xì)胞因子和趨化因子，在神經(jīng)炎癥過程中這些因子的表達(dá)顯著增加[32]。激活小膠質(zhì)細(xì)胞可通過TLR4/MyD88/ NF-κB 等信號(hào)通路誘導(dǎo)靶細(xì)胞炎性基因表達(dá)[33]。因此，嚴(yán)格調(diào)控這些信號(hào)級(jí)聯(lián)對(duì)于預(yù)防慢性神經(jīng)炎癥至關(guān)重要。我們首先通過 Western blot 檢測(cè)脊髓中TLR4/MyD88/ NF-κB 信號(hào)蛋白的變化。EAE 組 TLR-4 的相對(duì)表達(dá)量為 0.788±0.095，MyD88 為 0.377±0.024，p-NF-κB 為 0.265±0.028；相應(yīng)的 BB 治療組分別為 0.542±0.096、0.148±0.027 和 0.081±0.012。如圖 3a 所示，與 EAE 小鼠相比，BB 治療組 TLR4、MyD88、p- NF-κB p65 的表達(dá)水平明顯下降（p<0.01）。隨后，用 ELISA 測(cè)定了在脊髓蛋白中表達(dá)的與小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的典型的促炎細(xì)胞因子 IL-1β 和 TNF-α 和抗炎性細(xì)胞因子IL-10 及 TGF-β（圖 3b）。我們注意到 BB 的治療導(dǎo)致了 TNF-α 的明顯下降（p<0.05），同時(shí)引起了 IL-10 和 TGF-β 顯著增加，p 值分別小于 0.01。盡管無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，IL-1β的表達(dá)水平也顯示出類似的下降趨勢(shì)（圖 3b）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2830663