目的:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)滑膜腫脹為主要特征的慢性炎癥自身免疫性疾病,發(fā)病率為0.5%-]%左右,是世界范圍內(nèi)難治性的重大疾病之一。由于RA的病因與癥候的復(fù)雜性,目前尚未找到特效的治療RA的藥物,迫切需要開發(fā)新型治療藥物。類葉牡丹有效部位能夠調(diào)控炎癥細(xì)胞因子水平,調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫及體液免疫功能,同時能夠抑制血管新生、減緩滑膜血管翳的形成與增殖,減輕關(guān)節(jié)軟骨及骨的破壞,對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎免疫等亢進(jìn)性疾病具有良好治療作用。本文對其抗RA作用及作用機(jī)制進(jìn)行了分析。方法:MTT方法檢測類葉牡丹有效部位及其特征性成分對L929細(xì)胞的毒性,確定類葉牡丹有效部位及其特征性成分的給藥濃度范圍;采用MTT方法確定誘導(dǎo)劑TN F-α的誘導(dǎo)濃度并建立小鼠成纖維L929細(xì)胞炎性反應(yīng)模型,采用Elisa酶聯(lián)免疫技術(shù)以IL-6表達(dá)水平為指標(biāo)對類葉牡丹有效部位及其特征性成分的抗炎活性進(jìn)行比較,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)一步確定有效部位的有效濃度l采用LncRNA-mRNA芯片技術(shù),篩選空白組與模型組,類葉牡丹有效部位給藥組與模型組之間的差異基因,并對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類富集分析,尋找類葉牡丹有效部位抗RA的潛在靶點和通路l利用qPCR檢測空白組、模型組及給藥組三組之間Hist1h2bj、Hist1h2ba、Zfp36、Ccl3、Cxcl2、Egr1的表達(dá)情況,驗證類葉牡丹有效部位對上述因子的調(diào)控作用,以驗證與芯片數(shù)據(jù)的一致性。結(jié)果:MTT法測定結(jié)果顯示,在特征性成分濃度相同時,毒性由大到小順序為CLC、葳嚴(yán)仙堿B、木蘭堿、N-甲基金雀花堿,通過統(tǒng)計學(xué)分析計算出類葉牡丹有效部位、CLC、木蘭堿、N-甲基金雀花堿、葳嚴(yán)仙堿B的 IC50 值分別為 199.87μg/mL、809.19μM、3172.92μM、4754.46μM、2838.307μM,確定給藥濃度范圍需低于其IC50值。通過MTT方法確定誘導(dǎo)劑TNF-a的誘導(dǎo)濃度為5 ng/mL,Elisα法檢測IL-6的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),類葉牡丹有效部位、CLC、木蘭堿、N-甲基金雀花堿、葳嚴(yán)仙堿B在降低IL-6水平中均呈現(xiàn)劑量依賴性,同濃度下特征性成分降低IL-6的水平由高到低為CLC葳嚴(yán)仙堿B木蘭堿N-甲基金雀花堿。CLC抗炎作用為特征性成分中最好,葳嚴(yán)仙堿B與CLC降低IL-6水平較為接近,但與有效部位相比降低IL-6水平均低于有效部位,選擇抗炎效果較好的有效部位進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果顯示,TNF-α誘導(dǎo)后的L929細(xì)胞呈現(xiàn)形態(tài)輪廓不清晰,邊緣不整齊,細(xì)胞相對密度減小,大部分細(xì)胞皺縮變圓并出現(xiàn)破碎現(xiàn)象。與15.625 μg/mL、3 1.25 μg/mL、62.5 μg/mL類葉牡丹有效部位共同孵育組均能對細(xì)胞形態(tài)有所修復(fù),細(xì)胞輪廓清晰,能明顯看到細(xì)胞的核仁等內(nèi)部結(jié)構(gòu),且細(xì)胞數(shù)目增多,梭形狀態(tài)細(xì)胞增多,皺形狀態(tài)細(xì)胞減少。當(dāng)濃度達(dá)到125 μg/mL時,反而對細(xì)胞形態(tài)修復(fù)作用減弱,梭形細(xì)胞數(shù)目減少,皺形細(xì)胞數(shù)目增多,細(xì)胞邊緣不清晰,相對密度減小,確定有效部位有效濃度為62.5 μg/mL。LncRNA-mRN A芯片數(shù)據(jù)顯示,TNF-α模型組與空白組相比,差異基因總數(shù)為433條,其中上調(diào)基因298條,下調(diào)基因135條;類葉牡丹有效部位給藥組與模型組相比,差異基因總數(shù)為384條,其中上調(diào)基因202條,下調(diào)基因1 82條。篩選獲得與藥物作用顯著相關(guān)基因:Hist 1 h2ak、Hist 1 h2bf、Hist1h2ba、Hist1h2ao、Hist1h2an、Jun、Hist1h2ai、Hist1h2ag、Hist1h3a、Hist1h3i、Hist1h2bc、Hist1h2bn、Hist1h3e、Hist2h4、Hist1h2af、Hist1h4j、Hist1h3g、Hist1h4f、Hist1h4k、Hist1h4c、Ptgs2、Egr1、Tlr2、Hist1h1a、Serpine1、Ccl7、Fosb、Nfkbia、Ccl3、Cyr61、Lrr1、Ier2、Cdkn3、Cxcl3、Kif11、Psmd8、Dub2a、Tmeml73、Dub1、Klf6、Cab391、Dusp5、Gdfl5,且對于參與RA發(fā)生和發(fā)展的多條通路有顯著作用,通過基因芯片數(shù)據(jù)GO富集分析,發(fā)現(xiàn)類葉牡丹有效部位在分子功能上主要作用于趨化因子,在生物過程中主要影響蛋白DNA復(fù)合物的組裝、核小體組裝、染色質(zhì)組裝與分解、DN A合成、DN A構(gòu)象變化、蛋白聚合細(xì)胞白細(xì)胞介素-1響應(yīng),在細(xì)胞組成中主要對核核小體和核小體有影響,用富集原理得出具有富集功能的KEGG pathway,發(fā)現(xiàn)類葉牡丹有效部位主要影響了細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)的代謝(類固醇、糖類、氨基酸、維生素等物質(zhì)的代謝與合成),還影響了 NF-κB信號通路、MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、TNF信號通路等炎性通路,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病的通路,VEGF信號血管通路,Wnt信號通路、Jak-stat信號通路等骨細(xì)胞通路及細(xì)胞凋亡通路、細(xì)胞癌通路等通路。通過qPCR驗證芯片篩選出的差異基因,結(jié)果表明,類葉牡丹有效部位較模型組能顯著增加Hist1h2ba、Egr1、Ccl3的mRNA表達(dá),降低Hist1h2bj、Zfp36、Cxcl2的mRNA表達(dá),與芯片數(shù)據(jù)一致,可能成為治療RA的新靶點。結(jié)論:類葉牡丹有效部位對于生物過程和細(xì)胞組成影響較大,影響蛋白DNA復(fù)合物的組裝、核小體組裝、染色質(zhì)組裝與分解、DNA合成、DNA構(gòu)象變化、蛋白聚合細(xì)胞白細(xì)胞介素-1響應(yīng),在細(xì)胞組成中主要通過調(diào)控組蛋白基因家族影響核核小體和核小體的組成,在分子功能上主要作用于趨化因子,包括趨化因子的活化、轉(zhuǎn)移、與受體結(jié)合及其介導(dǎo)的信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響RA,類葉牡丹有效部位用主要影響了細(xì)胞的糖類、脂類、蛋白類三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝與合成,還參與調(diào)控NF-κB信號通路、MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、TNF信號通路等炎性通路,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病的通路,血管VEGF信號通路,Wnt信號通路、Jak-stat信號通路等骨細(xì)胞通路及細(xì)胞凋亡通路、細(xì)胞癌通路等。類葉牡丹有效部位可能通過調(diào)控炎性因子、組蛋白家族、趨化因子及其配體等與RA有關(guān)的細(xì)胞因子,對RA通路、TNF信號通路、Toll受體樣信號通路、趨化因子信號通路等與RA病程相關(guān)的通路產(chǎn)生顯著調(diào)控作用。
【學(xué)位單位】：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

達(dá)的調(diào)控作用。包括以下幾點：干擾其臨近基因的表達(dá)；促使ＲＮＡ結(jié)合蛋白到基因逡逑啟動子區(qū)，發(fā)揮調(diào)節(jié)功能；作為輔助因子對轉(zhuǎn)錄因子的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)；通過多種機(jī)制逡逑調(diào)節(jié)ＲＮＡ聚合酶］Ｉ的活性，實現(xiàn)對眾多基因表達(dá)水平的調(diào)控［２３＿２５］，如圖１－１。逡逑１．邋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ逡逑Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ逡逑＊邐邐（■■■■邐 丨邐＿￣ｍｍ邐ｍｍｍｍ邐＆■■■邐＊逡逑邐５邐＾＾—ｒ—逡逑２．邋Ｉｎｄｕｃｅ邋ｃｈｒｏｍａｔｉｎ邐Ｉ邋Ｈｙｂｎｄｉｚｘｉｏｎ邋0ｉ邐？ｃＲＮＡ５ｂ燦逡逑ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ邋ａｎｄ邐Ｉ邋ｆｌｎｄａｎｔｉ＾ｎｓｅ邋ＲＮＡ％邐ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｐｍｔｅｉｎ邐■逡逑ｈｉｓｔｏｎｅ邋ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ邐＾邐＞邋ｆ逡逑%煎危福澹櫻恚幔歟戾澹遙危鈴義希校潁澹悖酰潁螅錚蟈義希恚恚椋椋殄危幔恚螅螅佩義�，］忢，邋．ｃａｔｓｅ－逦ｍａｓｔｘｍ辶x希澹苠義希攏歟錚悖脲澹潁澹悖錚紓睿椋簦椋錚鑠澹錚駑澹澹錚鑠澹劐危希椋悖澹蟈澹茫歟澹幔觶幔紓邋義希猓澹簦瑁邋澹螅穡歟椋悖澹錚螅錚恚邋危擔(dān)澹停錚洌酰歟幔簦邋危罰澹粒歟簦澹蟈澹穡潁錚簦澹椋鑠義希穡潁錚簦澹椋鑠澹幔悖簦椋觶椋簦危歟錚悖幔歟椋幔簦椋錚鑠義希

本文編號：2830505