研究背景骨質(zhì)疏松癥是最常見的骨代謝疾病,已成為全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題之一,其表現(xiàn)為骨量減少、骨密度降低,骨組織微觀結(jié)構(gòu)的破壞,這些改變導(dǎo)致骨脆性增加,隨之增加了骨折發(fā)生的風(fēng)險。骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥最終的結(jié)果也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥,目前已成為中老年最常見的骨科疾病。骨質(zhì)疏松不僅導(dǎo)致骨折發(fā)生風(fēng)險增加,亦影響骨折固定的穩(wěn)定性和愈合過程,表現(xiàn)為骨痂形成量減少、質(zhì)量不佳,骨折愈合延遲,骨折愈合生物力學(xué)性能下降等。因此,考慮到骨質(zhì)疏松性骨折受損的骨愈合能力,在治療上有必要使用促進(jìn)骨折愈合的藥物和方法。在以往的研究中證實了骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)在骨質(zhì)疏松癥中與骨代謝和病理中的關(guān)系。Urist在發(fā)現(xiàn)BMPs20年后,把骨質(zhì)疏松癥癥描述為骨形態(tài)發(fā)生蛋白自身免疫性疾病,這導(dǎo)致科學(xué)界開始關(guān)注BMPs是否參與了骨質(zhì)疏松癥的病理過程,并把BMPs作為治療靶點進(jìn)行研究。有學(xué)者認(rèn)為可以通過操控BMPs和它們拮抗劑中間的平衡關(guān)系(作為成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞生成和骨重建比率的決定性因素)來引入一種全新的骨代謝疾病治療方式。有研究指出在骨質(zhì)疏松癥狀態(tài)下,骨組織內(nèi)BMPs含量的降低,致使骨生成減少。因此應(yīng)用BMPs直接促進(jìn)骨折愈合是未來骨組織修復(fù)的方向之一。自從骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)被發(fā)現(xiàn)、純化、基因克隆以來,重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2)對整個骨科都產(chǎn)生了巨大的影響。美國食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)在骨折處局部應(yīng)用rhBMP-2促進(jìn)脛骨骨折的愈合,以減少延遲愈合和不愈合的發(fā)生率。考慮到骨質(zhì)疏松性骨折中BMP-2水平下降和表達(dá)延遲。現(xiàn)已有多個實驗研究在骨折局部應(yīng)用BMP-2以促進(jìn)和改善骨質(zhì)疏松骨折的愈合,并取得較為滿意的效果。對骨質(zhì)疏松性骨折局部應(yīng)用BMP-2的優(yōu)勢包括:操作方便,局部給藥對全身干擾少,作用部位精準(zhǔn),可快速增加骨折局部的骨量和促進(jìn)骨折愈合。但目前rhBMP-2生物利用率低,載體釋放曲線不理想,導(dǎo)致局部需要大劑量應(yīng)用,這也產(chǎn)生了一系列的并發(fā)癥。為了能取得最滿意的成骨效果同時避免并發(fā)癥,除了改善釋放載體以獲得更好的rhBMP-2釋放曲線,目前越來越多的學(xué)者將目光投向聯(lián)合用藥,將局部rhBMP-2應(yīng)用和使用全身藥物聯(lián)合協(xié)同起來提高BMP-2的利用效率,以減少在局部外源性rhBMP-2的使用劑量。對于骨質(zhì)疏松性骨折rhBMP-2聯(lián)合全身抗骨質(zhì)疏松藥物使用,既可以加速骨折的修復(fù),又可以抗骨質(zhì)疏松治療似乎是骨質(zhì)疏松性骨折治療最理想的選擇。目前在臨床應(yīng)用的一線抗骨質(zhì)疏松治療和干預(yù)骨質(zhì)疏松性骨折的藥物,例如:二膦酸鹽類、狄諾塞麥和雌激素代替治療的主要機制是通過抑制破骨細(xì)胞,以減少骨吸收和降低骨轉(zhuǎn)換,其治療目標(biāo)為預(yù)防骨質(zhì)疏松性骨折的再發(fā)生。但這些抗骨質(zhì)疏松藥物對骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響尚不完全明確,對骨質(zhì)疏松性骨折愈合的作用也仍存爭議。骨質(zhì)疏松性骨折多發(fā)于中老年患者,這類人群骨折延遲愈合較為常見,有高達(dá)1/3的股骨干和脛骨骨折可能發(fā)生延遲愈合。因此,新一代的改善骨質(zhì)疏松性骨折愈合治藥物的目標(biāo),已不僅僅是單純的抑制骨吸收,而是同時能刺激成骨細(xì)胞的活性,加速骨形成。在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中,腎主骨是最重要的理論之一,腎虛被認(rèn)為是所有骨組織疾病的根源、包括:骨與關(guān)節(jié)損傷、退變和骨質(zhì)疏松癥等。傳統(tǒng)中醫(yī)對腎的理解是全身內(nèi)分泌功能的總稱,這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腎臟對鈣磷代謝調(diào)控功能所發(fā)揮內(nèi)分泌的功能是一致的,因此骨組織的質(zhì)量與腎功能密切相關(guān)。正是基于腎主骨的理論,千百年來補腎中藥常用于治療骨折和關(guān)節(jié)損傷等疾病。補骨脂味辛、苦,性溫,歸腎脾二經(jīng),是最常用的補腎中藥之一,也是中醫(yī)臨床上治療骨質(zhì)疏松癥和骨傷疾患的常用藥。補骨脂素是補骨脂主要有效活性成分,屬于呋喃香豆素類的植物雌激素。以往研究提示補骨脂素可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化,也能增加成骨細(xì)胞活性,刺激骨形成,并能抑制破骨細(xì)胞活性。我們的前期研究結(jié)果也證明補骨脂素灌胃治療可改善骨質(zhì)疏松動物模型的骨微觀結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能。研究目的本實驗通過建立骨質(zhì)疏松小鼠骨折模型,觀察補骨脂素聯(lián)合rhBMP-2對骨質(zhì)疏松小鼠骨折修復(fù)的影響。同時通過觀察血清骨代謝生化指標(biāo)和骨折對側(cè)股骨遠(yuǎn)端組織學(xué)的變化,探討補骨脂素聯(lián)合rhBMP-2對去卵巢骨質(zhì)疏松骨折期間骨質(zhì)疏松的影響。研究方法與內(nèi)容實驗一:130只9周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)3周后至12周齡到達(dá)性成熟。把130只C57BL/6J小鼠分為兩組,其中去卵巢組125只,假手術(shù)組5只。去卵巢組,背側(cè)切口行經(jīng)腹雙側(cè)卵巢切除,而假手術(shù)組在暴露卵巢后僅切除卵巢周圍少量脂肪組織。去卵巢術(shù)后6周,通過檢測小鼠體重,雌激素水平,子宮濕重和子宮、股骨HE染色的方法確認(rèn)骨質(zhì)疏松模型的建立。實驗二:在確認(rèn)建立骨質(zhì)疏松小鼠模型成功后,去卵巢組隨機分為4組:模型組,補骨脂素組,rhBMP-2組和聯(lián)合用藥組,每組30只。制作小鼠股骨中段骨折模型,模型組行股骨中段骨折植入可吸收明膠海綿(ACS)+生理鹽水灌胃,補骨脂素組行股骨中段骨折植入ACS+補骨脂素(20 mg/kg/d)溶液灌胃,rhBMP-2組行股骨中段骨折局部植入復(fù)合rhBMP2(2.5μg)的ACS+生理鹽水灌胃,聯(lián)合用藥組行股骨中段骨折局部植入復(fù)合rhBMP2(2.5μg)的ACS+補骨脂素(20 mg/kg/d)溶液灌胃。通過鉬靶X線、Micro-CT、組織學(xué)、熒光定量PCR和生物力學(xué)等檢測方法,觀察補骨脂素聯(lián)合rhBMP-2對骨質(zhì)疏松小鼠骨折修復(fù)的影響。實驗三:分組和實驗動物同實驗二,在骨折術(shù)后3周檢測各組小鼠血清骨代謝生化指標(biāo)和雌激素水平,同時觀察骨折對側(cè)股骨遠(yuǎn)端組織學(xué)的變化,以研究補骨脂素聯(lián)合rhBMP-2對去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠骨折期間骨質(zhì)疏松的影響。研究結(jié)果實驗一:小鼠去卵巢術(shù)后6周后,體重較假手術(shù)組明顯增加(P0.05),血清雌激素水平明顯下降(P0.05),子宮濕重明顯減低(P0.05);子宮HE染色切片的結(jié)果提示:與假手術(shù)比較,去卵巢組小鼠的子宮內(nèi)膜管壁明顯變薄,內(nèi)膜腺體明顯變少并腺體萎縮;以上結(jié)果說明小鼠去卵巢手術(shù)成功可靠。股骨遠(yuǎn)端HE染色切片顯示:去卵巢組小鼠股骨的骨皮質(zhì)變薄,骨小梁密度明顯稀疏、間距變寬,髓腔寬大,同時出現(xiàn)無骨小梁的骨髓區(qū),符合骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)。實驗二:骨折術(shù)后10天的X線和組織學(xué)結(jié)果顯示,與其他三組比較,聯(lián)合用藥組骨折兩端骨痂生成更多,骨痂密度較高,骨痂內(nèi)骨性骨痂明顯增多,成骨細(xì)胞更加活躍。骨折術(shù)后21天X線和Micro-CT結(jié)果顯示,聯(lián)合用藥組骨折較其它三組愈合更為充分,骨痂完全覆蓋骨折斷端,骨折線消失,骨折基本愈合。聯(lián)合用藥組的礦化骨痂體積(BV)、礦化骨痂百分比(BV/TV)和平均礦化密度(TMD)明顯高于其他3組(P0.05)。骨折21天組織學(xué)檢測提示,其它3組仍可見較多軟骨骨痂,聯(lián)合治療組骨痂區(qū)域充滿大量的較成熟的骨痂、部分連接成片,骨痂已處于吸收塑性階段。補骨脂素組和聯(lián)合用藥組骨痂中破骨細(xì)胞數(shù)量更稀少,但4組破骨細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核數(shù)量未見明顯差異。免疫組化結(jié)果顯示,聯(lián)合用藥組和補骨脂素組的BMP-2陽性AO值明顯高于模型組和rhBMP-2組(P0.05)。補骨脂素、rhBMP-2組和聯(lián)合用藥組骨礦化沉積率(MAR)明顯高于模型組。與模型組比較,補骨脂素和rhBMP-2組有顯著性差異(P0.05),聯(lián)合用藥組有極顯著性差異(P0.01)。聯(lián)合用藥組術(shù)后10天和21天Osteocalcin和Osterix基因表達(dá)水平都明顯高于模型組。聯(lián)合用藥組擁有最佳的生物力學(xué)性能,彎曲彈性模量,最大載荷和最大應(yīng)力都明顯高于模型組(P0.05)。實驗三:術(shù)后21天血清學(xué)檢查結(jié)果顯示,與模型組比較,補骨脂素組、rhBMP-2組和聯(lián)合用藥組BALP水平都有不同程度升高,但只有聯(lián)合治療組有顯著性差異(P0.05);補骨脂素組和聯(lián)合用藥組血清CTX-I水平明顯低于模型組和rhBMP-2組(P0.05);模型組、補骨脂素組、rhBMP-2組和聯(lián)合用藥組血清雌激素水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。股骨組織學(xué)觀察顯示4組骨組織形態(tài)中骨皮質(zhì)差異并不十分明顯,與模型組比較,rhBMP-2組在形態(tài)上無明顯差異,補骨脂素組和聯(lián)合用藥組小鼠松質(zhì)骨形態(tài)結(jié)構(gòu)相對完整,骨小梁數(shù)量增多變致密且較均勻。補骨脂素組和聯(lián)合用藥組小鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端的TRAP染色陽性的細(xì)胞的數(shù)量明顯少于較模型組和rhBMP-2組(P0.05)。研究結(jié)論1.使用12周齡C57BL/6J雌性小鼠,采用手術(shù)去卵巢去勢6周,能較好的模擬絕經(jīng)后女性因雌激素缺失對骨量丟失造成的影響,可作為制作骨質(zhì)疏松動物模型的可靠方法。2.采用補骨脂素口服和rhBMP-2局部聯(lián)合用藥能到達(dá)在骨質(zhì)疏松小鼠骨折局部早期BMP-2迅速靶向釋放,刺激成骨細(xì)胞增殖、分化,同時補骨脂素通過持續(xù)口服給藥,可在骨折愈合中晚期持續(xù)增加成骨細(xì)胞Osteocalcin、Osterix基因和骨折局部BMP-2的表達(dá)水平,協(xié)同增加成骨細(xì)胞活性,加速骨折修復(fù),效果優(yōu)于rhBMP-2和補骨脂素單獨用藥。補骨脂素能平衡破骨細(xì)胞功能,不影響骨痂重塑過程。這一結(jié)果表明,補骨脂素和rhBMP-2聯(lián)合用藥有可能減少單獨局部rhBMP-2和全身補骨脂素的使用劑量,減少兩者大劑量使用的副反應(yīng),提高臨床效果和成本效益。3.補骨脂素作為一種天然植物雌激素,可能對雌激素受體選擇性的發(fā)揮了作用,不明顯增加體內(nèi)雌激素水平,聯(lián)合用藥能調(diào)動骨折局部和全身成骨細(xì)胞活性,并能抑制破骨細(xì)胞在一定程度上減少骨吸收,改善骨質(zhì)疏松癥骨組織的微觀結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

變小和骨密度減低，最終骨折愈合生物力學(xué)性能下降。在一項研究中作者使用去卵巢和低鈣飲食骨質(zhì)疏松造模，采用不穩(wěn)定大鼠股骨骨折過程骨質(zhì)疏松對骨折愈合的影響，結(jié)果顯示骨折 3 周后與假手術(shù)組比骨質(zhì)疏松組骨痂生成面積減少，骨密度下降，骨折愈合生物力學(xué)性能下降，骨痂的組織學(xué)也顯示成熟骨痂生成不足和質(zhì)量下降。因此作者骨質(zhì)疏松性骨折早期愈合受損，骨形成與骨痂成熟過程遲緩，易發(fā)生延遲愈合和不愈合。T Kubo 采用同樣的動物模型，觀察到骨折后 12結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松組在骨折愈合處骨痂有骨質(zhì)疏松表現(xiàn)，骨密度下降者認(rèn)為骨的生物力學(xué)性能出現(xiàn)明顯下降，這可能與早期愈合過程中的存在密切聯(lián)系[34]。還有研究顯示骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨密度明顯下降，骨折緩慢、延遲，骨折愈合強度下降[35]，與正常骨折相比，骨質(zhì)疏松性骨痂內(nèi)骨小梁骨表面成骨細(xì)胞數(shù)量減少、成骨能力降低，骨折的愈合質(zhì)[36]。

實驗小鼠

卵巢切除

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本文編號：2830333