研究背景惡性腹水是由各種惡性腫瘤引起的腹水,多由腫瘤進(jìn)展或轉(zhuǎn)移引起。惡性腹水患者的平均生存期約為2-3個(gè)月,尤以胃腸道來(lái)源的最差,生存期不超過(guò)20周。腫瘤患者出現(xiàn)腹水,不僅會(huì)帶來(lái)巨大的痛苦,更延誤了積極的治療機(jī)會(huì),甚至引起營(yíng)養(yǎng)匱乏、病情惡化,使生存期明顯縮短。因此,如何有效減少惡性腹水,并減輕由此引起的相關(guān)臨床癥狀,提高生存質(zhì)量顯得尤為重要。目前,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療手段主要包括利尿、腹腔穿刺引流、化療、免疫治療等。中醫(yī)藥因其副作用小、療效好,在腫瘤治療中越來(lái)越顯示出其優(yōu)勢(shì)。華蟾素注射液作為干蟾皮的主要提取物,已廣泛應(yīng)用于臨床中惡性腹水的治療,具有較好的臨床療效,尤其對(duì)腹水局部辨證屬于濕熱毒證者療效最佳。華蟾素注射液不僅能夠有效緩解惡性腹水的發(fā)生、發(fā)展,同時(shí)能夠使紅色渾濁的腹水轉(zhuǎn)澄清、降低腹水中紅細(xì)胞數(shù)。其原因可能與華蟾素注射液能夠抑制腫瘤新生血管形成相關(guān)。VEGF及其受體是促進(jìn)血管生成的主要參與因子,在惡性腹水的形成和治療方面發(fā)揮重要作用。因此,研究華蟾素注射液與結(jié)腸癌惡性腹水中VEGF及其受體之間的關(guān)系,對(duì)明確華蟾素注射液治療結(jié)腸癌惡性腹水的機(jī)制、提高結(jié)腸癌惡性腹水的治療療效至關(guān)重要。基于上述內(nèi)容,我們猜測(cè)華蟾素注射液能夠抑制腹水中VEGF的表達(dá),阻斷VEGF與VEGFR-2的結(jié)合,減緩腫瘤新生血管形成,從而減少惡性腹水的產(chǎn)生。研究目的通過(guò)本研究,希望了解結(jié)腸癌血性腹水中,華蟾素注射液對(duì)VEGF、VEGF-mRNA和VEGFR-2等細(xì)胞信號(hào)通路的影響,明確華蟾素注射液對(duì)結(jié)腸癌腹膜轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路VEGF表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,初步闡述華蟾素注射液在治療結(jié)腸癌腹水時(shí)的具體作用靶點(diǎn)和作用途徑。研究方法本研究主要包括動(dòng)物和細(xì)胞兩部分實(shí)驗(yàn),通過(guò)華蟾素注射液分別干預(yù)動(dòng)物和細(xì)胞模型,從蛋白和基因?qū)用娼沂救A蟾素注射液治療結(jié)腸癌血性腹水時(shí)干預(yù)VEGF及其受體表達(dá)的情況,探索華蟾素注射液干預(yù)結(jié)腸癌血性腹水的可能機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(華蟾素注射液干預(yù)荷瘤小鼠血性結(jié)腸癌腹水VEGF表達(dá)的研究)主要包括以下四部分內(nèi)容:1、建立動(dòng)物模型:我們嘗試不同接種途徑、不同細(xì)胞類型、不同接種劑量對(duì)小鼠的影響,建立符合課題需求的荷瘤小鼠血性腹水模型。2、華蟾素注射液劑量確定:我們?cè)O(shè)計(jì)并進(jìn)行華蟾素注射液腹腔灌注的急性毒性試驗(yàn),通過(guò)判斷不同劑量干預(yù)后小鼠腹腔內(nèi)各臟器的病理改變,明確華蟾素注射液的腹腔灌注安全劑量。3、荷瘤小鼠腹水量變化研究:藥物干預(yù)后觀察并記錄各組小鼠腹水產(chǎn)生情況。4、荷瘤小鼠VEGF、VEGF-mRNA、VEGFR-2表達(dá)的影響:采用ELISA檢測(cè)血性結(jié)腸癌腹水VEGF表達(dá)水平;WB檢測(cè)小鼠腸系膜轉(zhuǎn)移瘤VEGF、VEGFR-2含量;qPCR檢測(cè)小鼠腸系膜轉(zhuǎn)移瘤中VEGF-mRNA、VEGFR2-mRNA。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(華蟾素注射液干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞代謝變化研究)主要包括以下兩部分內(nèi)容:1、華蟾素干預(yù)下HUVEC增殖變化:MTT檢測(cè)HUVEC細(xì)胞凋亡情況;熒光顯微鏡觀察用藥前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。2、華蟾素干預(yù)下HUVEC中VEGF、VEGFR-2、VEGF-mRNA表達(dá)的影響:ELISA檢測(cè)HUVEC細(xì)胞上清液中VEGF含量和細(xì)胞膜表面VEGFR-2含量;qPCR測(cè)定HUVEC細(xì)胞中 VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA 含量。研究結(jié)果1、結(jié)腸癌血性腹水的動(dòng)物模型建立方法主要包括脾臟接種腫瘤細(xì)胞和腹腔接種腫瘤細(xì)胞兩種。脾臟接種的方法更優(yōu)于腹水的收集和計(jì)量,腹腔接種的方法則適用于與結(jié)腸癌腹水產(chǎn)生密切相關(guān)的腸、腹壁轉(zhuǎn)移瘤的研究。2、華蟾素注射液腹腔灌注劑量不超過(guò)1ml時(shí),不會(huì)引起小鼠肝、脾、腎臟器急性壞死,不會(huì)影響小鼠的體重、飲食等,屬于安全劑量。3、華蟾素注射液呈濃度依賴性抑制荷瘤小鼠腹腔中腹水的含量。4、華蟾素注射液未降低脾臟組裸鼠血性腹水中VEGF表達(dá)量,各組腹水中VEGF含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。腹腔組BALB/c小鼠腸系膜轉(zhuǎn)移瘤中VEGF與VEGFR-2表達(dá)量在不同濃度華蟾素作用下均呈現(xiàn)不同程度降低,由高到低的表達(dá)量分別為低劑量、中劑量、高劑量,該變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�？梢�(jiàn),華蟾素注射液呈濃度依賴性抑制小鼠腸系膜轉(zhuǎn)移瘤中VEGF與VEGFR-2的表達(dá)。5、華蟾素注射液呈濃度依賴性降低腹腔組BALB/c小鼠腹腔轉(zhuǎn)移瘤中VEGF-mRNA與VEGFR2-mRNA表達(dá)量,該變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。其中,高劑量華蟾素注射液對(duì)兩種mRNA的抑制作用最強(qiáng),中劑量其次,低劑量抑制作用最弱。6、華蟾素注射液對(duì)HUVEC細(xì)胞有明顯生長(zhǎng)抑制作用,其抑制率在10-80%之間,半數(shù)抑制濃度(IC50)為1mg/ml,藥物最佳作用時(shí)間為24h。24h內(nèi),華蟾素注射液對(duì)HUVEC干預(yù)呈“時(shí)間-濃度”依賴性。7、華蟾素注射液呈濃度依賴性抑制HUVEC細(xì)胞VEGF及VEGFR-2的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其對(duì)VEGFR-2的抑制作用更高于相同劑量下對(duì)VEGF的作用(P0.001)。8、華蟾素注射液能夠抑制HUVEC細(xì)胞VEGF-mRNA和VEGFR2-mRNA的表達(dá),且該抑制作用呈濃度依賴性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。研究結(jié)論我們成功建立荷瘤小鼠結(jié)腸癌血性腹水模型和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型。在動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,我們均從基因和蛋白層面,明確了華蟾素注射液對(duì)VEGF及其受體的下調(diào)作用,同時(shí)發(fā)現(xiàn)華蟾素注射液雖對(duì)VEGF及其受體均有抑制作用,但對(duì)VEGFR-2的抑制尤其明顯。進(jìn)一步揭示了華蟾素注射液治療結(jié)腸癌血性腹水的可能機(jī)制是下調(diào)VEGF及其受體,特別是降低VEGFR-2的表達(dá),抑制腫瘤新生血管形成,從而為華蟾素注射液治療結(jié)腸癌血性腹水提供了科學(xué)依據(jù)。本研究從分子層面證實(shí)華蟾素注射液對(duì)結(jié)腸癌血性腹水中信號(hào)通路VEGF表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,為推廣華蟾素注射液腹腔灌注應(yīng)用于臨床中治療結(jié)腸癌血性腹水提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),為華蟾素抗腫瘤的機(jī)制研究提供了新思路。未來(lái)研究將繼續(xù)對(duì)華蟾素注射液抗腫瘤新生血管作用進(jìn)一步驗(yàn)證并深入探究其分子機(jī)制。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

注：圖１－ａ肝血管竇擴(kuò)張（箭頭所示），周圍伴部分肝細(xì)胞壞死；圖１－ｂ匯管區(qū)可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸逡逑潤(rùn)（箭頭所示），伴部分肝細(xì)胞水腫、壞死；圖１－ｃ肝小葉結(jié)構(gòu)完整，部分肝細(xì)胞變性（箭頭所示）。逡逑觀察腎臟切片（圖２），腎臟皮髓質(zhì)分界清楚，腎小球毛細(xì)血管部分有淤血，部分逡逑腎小球有硬化，系膜細(xì)胞和基質(zhì)X椛幻饗�，婶櫋谷O掀は赴斜湫�，未见秽嚌慎|噱義霞渲飾醇溲�、水譁�(zhǔn)把紫赴�。各讬{鱸嗨鷙幻饗�，其病睖Z牟課恢饕性阱義仙魴∏虻撓不�。辶x希垮澹А觶誨澹у澹В鰣義銜瘛觶義賢跡不桿兀賀�？预蠟础鼠慎|嗖±砬釁ǎ齲湃舊�，２００Ｘ）辶x獻(xiàn)ⅲ翰糠稚魴∏蠆Ａа匪荊�，毛隙挭管轻度淤血，无充血、水譁�(zhǔn)把紫赴�。辶x瞎鄄炱⒃嗲釁ㄍ跡常�，脾脏皮髓质芳埦_磺�，脫]忻魅費(fèi)字⑾赴�，各组小屎j義弦┪鎪鷙Σ幻饗�。辶x希叮插義

本文編號(hào)：2829422