藥物進(jìn)入體內(nèi)后在代謝酶的作用下發(fā)生結(jié)構(gòu)性的改變,產(chǎn)生毒性或活性代謝物。其中肝臟是藥物產(chǎn)生代謝物的主要器官,肝微粒體溫孵模型是最常用的體外代謝體系。藥物的體內(nèi)代謝研究較全面地闡明藥物的代謝途徑,為臨床藥物治療和毒副作用監(jiān)測奠定了基礎(chǔ)。中藥鴨跖草化學(xué)成分復(fù)雜,主要用于風(fēng)熱感冒、高燒不退、咽喉腫痛、水腫尿少、熱淋澀痛和癰腫疔毒。但是《中國藥典》2015年(一部)未收載鴨跖草的含量測定。因此,本研究旨在建立高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析中藥大薊中主要黃酮化合物在大鼠體內(nèi)的代謝途徑;鑒別漆黃素、槐角苷和甘草苷單體成分分別在大鼠體內(nèi)外的代謝產(chǎn)物;識別鴨跖草化學(xué)成分及其多組分含量測定。第一部分中藥大薊中主要黃酮類成分的體內(nèi)代謝研究目的:建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS法分析中藥材大薊提取物中主要黃酮類成分在大鼠體內(nèi)的代謝途徑。方法:大鼠灌胃給予大薊提取物后,收集血漿、尿液和膽汁生物樣品,采用液-液萃取方法進(jìn)行樣品前處理。首先采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù),ESI源正離子模式監(jiān)測,全掃描結(jié)合多重質(zhì)量虧損(MMDF)和動態(tài)背景扣除(DBS),在線采集數(shù)據(jù),采用多種數(shù)據(jù)處理方法篩選主要黃酮類化合物(柳穿魚葉苷、蒙花苷和柳穿魚黃素)可能的代謝物。根據(jù)代謝物的精確分子質(zhì)量、元素組成、二級質(zhì)譜圖、相關(guān)的生物轉(zhuǎn)化規(guī)律和母藥化合物的裂解規(guī)律,推斷中藥大薊提取物的可能代謝物。同時,引進(jìn)Clog P值重要參數(shù),以區(qū)分同分異構(gòu)體。色譜柱Poroshell 120 EC-C_(18)(2.1×100mm,2.7μm),配有SecurityGuard~?UHPLC C_(18)預(yù)柱(Poroshell);流動相為水(0.1%甲酸)-甲醇,梯度洗脫,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣量為5μL。結(jié)果:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)識別了12種吸收組分,共鑒定了25種代謝物。實驗發(fā)現(xiàn)水解反應(yīng)是柳穿魚葉苷和蒙花苷代謝的第一步,然后氧化和還原反應(yīng)發(fā)生,但是未檢測到柳穿魚葉苷和蒙花苷的結(jié)合代謝物。實驗總結(jié)了柳穿魚黃素代謝途徑,主要包括氧化、還原、水解、葡萄糖醛酸化和葡萄糖結(jié)合反應(yīng)。結(jié)論:本研究首次采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析大薊提取物中主要黃酮類化合物的代謝物,為大薊進(jìn)一步的藥理學(xué)和藥物活性研究奠定了基礎(chǔ)。本方法簡便、快速,適用于中藥材的體內(nèi)代謝產(chǎn)物的分析。第二部分漆黃素的體內(nèi)外代謝研究目的:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析漆黃素單體成分在大鼠體內(nèi)外的代謝產(chǎn)物。方法:建立I相溫孵體系:1.0 mg/mL肝微粒、3.3 mmol/L MgCl_2、1.3 mmol/Lβ-NADPH和100μmol/L漆黃素對照品溶液(甲醇占總體積的1%);建立II相溫孵體系:1.0 mg/mL鼠肝微粒體、2 mmol/L UDPGA、8 mmol/L MgCl_2、25μg/mL丙甲菌素和100μmol/L漆黃素對照品溶液(甲醇占總體積的1%)。大鼠灌胃給予漆黃素混懸液后,分別收集血漿、尿液、膽汁和糞便生物樣品,體外I相代謝樣品預(yù)處理采用液-液萃取方法,而體外II相體系和體內(nèi)生物樣品采用甲醇沉淀蛋白的方法進(jìn)行樣品前處理。結(jié)果:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法共鑒定了漆黃素在大鼠肝微粒中14種代謝物,體內(nèi)53種代謝物(11種I相代謝物和42種II相代謝物),其中,血中18種、尿液49種、膽汁34種和糞便34種代謝物。漆黃素的主要代謝途徑為氧化、還原、葡萄糖醛酸化和硫酸鹽結(jié)合反應(yīng)。實驗發(fā)現(xiàn)氧化和丟失氧原子反應(yīng)是發(fā)生甲基化、氫化、硫酸化和葡萄糖醛酸化反應(yīng)的基礎(chǔ)反應(yīng)。結(jié)論:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法鑒定漆黃素在大鼠體內(nèi)外的代謝物,結(jié)果顯示UHPLC-Q-TOF-MS/MS是識別藥物代謝物的強(qiáng)有力的工具,將會引導(dǎo)理解藥物的生物轉(zhuǎn)化,為藥物的臨床應(yīng)用和藥理研究奠定理論基礎(chǔ)。第三部分槐角苷的體內(nèi)外代謝研究目的:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法分析槐角苷單體成分在大鼠體內(nèi)外的代謝產(chǎn)物及其代謝途徑。方法:分別建立I相和II相溫孵體系,大鼠灌胃給予槐角苷混懸液后,分別收集血漿、尿液、膽汁和糞便生物樣品。體外I相樣品采用液-液萃取方法進(jìn)行前處理,體外II相和體內(nèi)的生物樣品前處理均采用甲醇沉淀蛋白的方法。色譜柱Poroshell 120 EC-C_(18)(2.1×100 mm,2.7μm),配有SecurityGuard~?UHPLC C_(18)預(yù)柱(Poroshell);流動相:水(0.1%甲酸)-甲醇,梯度洗脫,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣量為3μL。結(jié)果:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù),基于在線數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)加載策略,在大鼠體內(nèi)共鑒定了60種代謝物(I相代謝物22種和II相代謝物38種),其中在大鼠血漿中檢測到10種代謝物,在尿液中發(fā)現(xiàn)了46種代謝物,在大鼠膽汁中識別了35種代謝物,在大鼠糞便中識別了25種代謝物。此外,在大鼠肝微粒體體系中發(fā)現(xiàn)4種代謝物(2種I相和2種II相代謝物)�；苯擒罩饕�(jīng)歷了結(jié)合反應(yīng),包括甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化、谷胱甘肽結(jié)合、甘氨酸結(jié)合和乙酰化。而且在血漿、尿液、膽汁和糞便生物樣品中也檢測到了氧化、還原和水解代謝物,但是在體外溫孵體系中僅僅發(fā)現(xiàn)了氧化和水解I相代謝物。結(jié)論:本研究建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法,結(jié)合多種數(shù)據(jù)加載技術(shù)識別槐角苷的體內(nèi)外代謝產(chǎn)物,本研究將會更好的理解槐角苷的生物轉(zhuǎn)化和代謝機(jī)制,將會為其進(jìn)一步的藥理學(xué)和毒理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。第四部分甘草苷的體內(nèi)外代謝研究目的:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對甘草苷單體成分的體內(nèi)外代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。方法:分別建立I相和II相溫孵體系,大鼠灌胃給予甘草苷混懸液后,分別收集血漿、尿液、膽汁和糞便生物樣品。體外I相、II相和體內(nèi)生物樣品分別采用液-液萃取、甲醇沉淀蛋白和甲醇沉淀蛋白的方法進(jìn)行樣品前處理。采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)在線采集數(shù)據(jù),利用MetabolitePilot 1.5和PeakView 1.2數(shù)據(jù)加載軟件得到代謝物的精確質(zhì)量數(shù)、二級質(zhì)譜以及母藥甘草苷的裂解規(guī)律,推斷可能的代謝物。色譜柱Poroshell 120 EC-C_(18)(2.1×100 mm,2.7μm),配有SecurityGuard~?UHPLC C_(18)預(yù)柱(Poroshell);流動相:水(0.1%甲酸)-甲醇,梯度洗脫,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣量為3μL。結(jié)果:采用UHPLC-Q-TOF-MSMS技術(shù)在大鼠體內(nèi)共鑒定了56種代謝物(27種I相代謝物和29種II相代謝物),分別在大鼠血漿、尿液、膽汁和糞便識別了20、54、48和37種代謝物。此外,在大鼠肝微粒溫孵體系中共鑒定了15種代謝物(11種I相代謝物和4種II相代謝物)。甘草苷的主要代謝途徑為氧化、還原、水解、甲基化、乙�；⒘蛩峄推咸烟侨┧峄磻�(yīng)。結(jié)論:應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法分析甘草苷的體內(nèi)外代謝物。實驗結(jié)果為活性代謝物的篩選奠定基礎(chǔ),而且本研究展現(xiàn)了強(qiáng)有力的分析策略快速地篩選和識別傳統(tǒng)中藥的化學(xué)成分及其代謝物。第五部分鴨跖草中化學(xué)成分的定性定量研究目的:建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS法分析鑒定中藥鴨跖草的化學(xué)成分,同時,建立HPLC-MS/MS法同時測定鴨跖草中葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、芹菜素、原兒茶酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草素、槲皮素和異鼠李素13種化學(xué)成分的含量。方法:定性采用Poroshell 120 SB-C_(18)色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7μm),柱溫25°C,以水(0.1%的甲酸)-甲醇為流動相進(jìn)行梯度洗脫,體積流量0.3 mL/min,進(jìn)樣量1μL,采用正負(fù)離子模式同時監(jiān)測。定量采用Wonda Cract ODS-2 C_(18)柱(150 mm×4.6 mm,5μm),柱溫25°C,以水(0.1%的甲酸-2 mmol/L甲酸銨)-甲醇為流動相進(jìn)行梯度洗脫,體積流量0.8 mL/min,進(jìn)樣量10μL,采用電噴霧離子源進(jìn)行負(fù)離子模式監(jiān)測,多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),源噴射電壓為-4 500 V,離子源溫度為650°C。結(jié)果:本研究共檢測到62種化學(xué)成分,其中22種化學(xué)成分已與相應(yīng)對照品的保留時間和二級質(zhì)譜進(jìn)行比對,確認(rèn)其化學(xué)結(jié)構(gòu),40種化學(xué)成分根據(jù)二級質(zhì)譜進(jìn)行推斷。測定的13種化學(xué)成分的峰面積和濃度在測定范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r≥0.9991),加樣回收率為98.64%~100.8%,日內(nèi)和日間精密度RSD值分別小于1.04%和0.92%。結(jié)論:本法簡便快速、靈敏度高、專屬性好,可用于鴨跖草中13種化學(xué)成分的含量測定,為鴨跖草進(jìn)一步的藥代動力學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285;R284.1
【部分圖文】：

圖 3 柳穿魚葉苷（A）、蒙花苷（B）和柳穿魚黃素（C）的質(zhì)譜圖及其裂解途徑Fig. 3 The MS/MS spectra and predominant fragmentation patterns ofpectolinarin (A), linarin (B) and pectolinarigenin (C)

26圖 4 大鼠體內(nèi)代謝物的提取流圖（A1-2 血漿樣品、B1-5 尿液樣品、C1-2膽汁樣品）Fig. 4 Extracted ion chromatograms of all metabolites in rat (A1-2 in rat bloodsample, B1-5 in rat urine sample, C1-2 in rat bile sample)

代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜圖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2828302