目的:雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide,TPL)是雷公藤最主要的有效成分和毒性物質(zhì)。TPL具有高效的免疫抑制、抗腫瘤、抗炎、抗生育等作用,在這些領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。然而TPL毒性大且治療窗窄,極易發(fā)生中毒,目前尚無拮抗劑。腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)是血液凈化技術(shù)的一種,利用腹膜作為透析膜清除體內(nèi)毒物,搶救成功率高。目前尚無文獻(xiàn)對TPL的可透析進(jìn)行科學(xué)的驗證,故建立大鼠腹膜透析(PD)模型研究PD對TPL及其代謝物的清除作用,對TPL的可透析性進(jìn)行了探討,為將來TPL應(yīng)用于臨床發(fā)生急性中毒情況時,運用PD等血液凈化方式救治TPL中毒患者提供試驗依據(jù)。方法:1、采用LC-MS結(jié)合平衡透析法,選擇25、50、100ng/ml三個濃度對TPL在SD大鼠、Beagle犬及人血漿中的蛋白結(jié)合率進(jìn)行測定。2、建立大鼠PD模型,通過優(yōu)化不同的腹透周期、腹透劑量,確定最佳的PD方案。3、將大鼠分為TPL組和TPL+PD組。TPL組:大鼠單次尾靜脈LD50劑量的TPL后在規(guī)定時間內(nèi)采血;TPL+PD組:大鼠iv TPL后即刻進(jìn)行PD,并在規(guī)定時間內(nèi)采血。收集血漿及腹透液樣品后用LC-MS測定血漿及腹透液中TPL的濃度,用藥動學(xué)DAS軟件計算藥動學(xué)參數(shù)并對兩組的動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較,并分析腹透液中的TPL變化規(guī)律。4、采用LC-MS技術(shù)分離鑒別TPL內(nèi)源性代謝物,并測定血漿及腹透液中TPL代謝物的濃度,用藥動學(xué)DAS軟件計算藥動學(xué)參數(shù)并對兩組的動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。5、iv LD50劑量的TPL染毒后的大鼠在不同時間取血,按照試劑盒說明書測ALT、AST、LDH、CRE、BUN。以空白血作為自身對照,研究TPL染毒后大鼠的生化指標(biāo)的變化,確定生化指標(biāo)的最佳檢測時間點。6、將大鼠分為正常組、假手術(shù)組、TPL組、TPL+PD組4組。正常組:iv等體積0.9%NS;假手術(shù)組:造模并iv等體積0.9%NS;TPL組:iv LD50劑量的TPL;TPL+PD組:造模并iv LD50劑量TPL后進(jìn)行PD。4組均在12h處死取血測ALT、AST、CRE、BUN,取心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行HE染色,對各組的血漿生化及病理改變進(jìn)行分析比較。結(jié)果:1、TPL與大鼠、Beagle犬和人血漿蛋白結(jié)合率均無濃度依賴性。TPL與SD大鼠的血漿蛋白結(jié)合率最高(41.02±1.28)%,與Beagle犬(31.25±3.60)%、人血漿(34.99±2.89)%相比均有極顯著性差異(p0.01);人血漿蛋白結(jié)合率和Beagle犬血漿蛋白結(jié)合率之間差異具有顯著性(p0.05)。2、成功建立大鼠PD模型。腹透周期為10min/cycle,腹透劑量為150ml/kg時透析出的TPL量最高。3、TPL消除快,在180min后低于檢測限。TLP+PD組的Cmax、AUC0~180明顯小于TPL組(p0.01);TPL+PD組的Vd大于TPL組(p0.05);TPL+PD組的CLz明顯大于TPL組(p0.01)。PD對TPL的清除率為26.66%。腹透液中TPL量以第1PD周期為最高,隨時間增加逐漸下降。4、TPL主要有4大類代謝物,雙羥基化雷公藤內(nèi)酯醇(有6種,命名為DHTPL1~6),羥基化雷公藤內(nèi)酯醇(有2種,命名為HTPL1~2)、甲基化雷公藤內(nèi)酯醇(MTPL)、脫水羥基化雷公藤內(nèi)酯醇(DHHTPL)。TPL代謝物消除較快,在大鼠體內(nèi)呈先上升后逐漸下降的趨勢,大部分代謝物在6min達(dá)到高峰。體內(nèi)滯留時間的順序為HTPLDHTPLMTPL=TPLDHHTPL,分別在6h、5h、2h、2h、1h后低于檢測限。5、TPL+PD組TPL代謝物的AUC均小于TPL組。PD對TPL各代謝物的清除率分別為DHTP1(22.08%)、DHTPL2(31.56%)、DHTPL3(24.29%)、DHTPL4(33.86%)、DHTPL5(25.34%)、DHTPL5(31.47%)、HTPL1(27.41%)、HTPL2(28.29%)、MTPL(14.87%)、DHHTPL(23.74%)。大部分代謝物在腹透液中的含量在第1PD周期達(dá)到最高,隨PD時間的增加逐漸下降。6、大鼠iv TPL后,短時間(約12h)內(nèi)血漿中的ALT、AST、LDH、BUN均呈先上升達(dá)到峰值后逐漸下降到正常水平的趨勢,12h時ALT、AST、LDH、BUN的水平與0h相比均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05或p0.01)。CRE變化不明顯。7、與正常組比較,TPL組和TPL+PD組ALT、AST、LDH、BUN水平均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05或p0.01),假手術(shù)組沒有明顯改變;TPL+PD組與TPL組比較,TPL+PD組的ALT、AST、LDH、BUN水平均低于TPL組(p0.05)。HE染色中,正常組、假手術(shù)組的大鼠均未見明顯病理改變;TPL組和TPL+PD組均有肝細(xì)胞受損、壞死,腎小管上皮細(xì)胞腫脹、少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞壞死、管腔分泌物增多,脾小結(jié)縮小、淋巴細(xì)胞壞死、數(shù)目減少等病理改變,TPL+PD組的肝細(xì)胞損害、腎小管管腔滲出物和淋巴細(xì)胞壞死程度輕于TPL組。結(jié)論:1、TPL具有較低的血漿蛋白結(jié)合率,在血漿中大部分游離;TPL與大鼠、Beagle犬和人血漿蛋白結(jié)合率無濃度依賴性;TPL血漿蛋白結(jié)合率具有種屬差異性。2、成功建立大鼠PD模型。最佳的PD方案為150ml/kg,10min/cycle。3、PD對TPL的清除率為26.66%。TPL主要有4大類代謝物,PD對TPL各代謝物的清除率約為15%~30%。TPL中毒時應(yīng)盡早使用PD,使TPL代謝物盡快排出體外。4、大鼠iv LD50劑量的TPL后12h可作為生化指標(biāo)的最佳檢測時間點。肝臟、腎臟、脾是TPL急性毒性作用重要的靶器官,PD能減輕TPL對肝、腎、脾的損害,并有利于血清酶ALT、AST、BUN、LDH水平的恢復(fù)。5、PD是TPL急性中毒的有效血液凈化手段,故發(fā)生TPL中毒時盡早使用PD等血液凈化方式清除TPL及其代謝物。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

44%）進(jìn)行洗脫。而對于透析外液緩沖液采用 Eclipse plus C18色譜柱，等度洗脫（水-甲醇=56：44），使 TPL 的出峰時間提前，節(jié)省整個分析周期。在此條件下測得的 TPL保留時間合適，峰型良好。3.2 血漿及緩沖液樣品預(yù)處理方法的選擇透析內(nèi)液（血漿）選擇乙酸乙酯液液萃取法；預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)緩沖液中的化學(xué)成分對色譜柱及質(zhì)譜并沒有明顯的影響，所以可直接進(jìn)樣測定。3.3 TPL 血漿蛋白結(jié)合率測定方法的選擇3.3 方法學(xué)驗證3.3.1 專屬性考察圖 1-1結(jié)果表明，在本實驗的色譜條件下，大鼠血漿中測得的 TPL的保留時間約為 2.84min（緩沖液中約為 3.02min），說明血漿和緩沖液中內(nèi)源性物質(zhì)及其它成分均不干擾 TPL的含量測定，且分離度良好，峰形良好。

圖 1-2 SD 大鼠血漿及緩沖液中 TPL 的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1-2 Quantitative standard curve of TPL in plasma and buffer of SD rats3.3.3 精密度與準(zhǔn)確度的考察結(jié)果見表 1-1，日內(nèi)和日間精密度 RSD均小于 5.0%，準(zhǔn)確度在 95%～105%，均符合《化學(xué)藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的基本要求。表 1-1 SD 大鼠模擬血漿和緩沖液樣品的精密度和準(zhǔn)確度考察結(jié)果（n=5）Tab.1-1 Precision and accuracy of TPL in simulated plasma and buffer samples of SD rats (n = 5)樣品TPL 添加濃度（ng/ml）日內(nèi)精密度RSD（%）日間精密度RSD（%）準(zhǔn)確度RR（%）模擬血漿樣品25 3.15 3.88 98.1650 1.82 2.22 103.75125 2.66 3.53 95.89模擬緩沖液樣品20 2.30 3.30 99.3150 0.49 3.71 102.3875 0.49 2.47 100.89

圖 1-3 血漿樣品的平衡時間考察結(jié)果(n=3， x s) 1-3 Results of equilibration time of plasma samples (n=3， 種屬血漿蛋白結(jié)合率的測定種屬的血漿蛋白結(jié)合率見表 1-5，結(jié)果 TPL蛋白結(jié)圍內(nèi)無濃度依賴性，SD大鼠血漿中 TPL三個濃度、40.82%，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）；Bea、28.21%，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）；人血，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。TPL蛋白結(jié)合D大鼠的血漿蛋白結(jié)合率最高 41.02±1.28 %，與 %、人血漿蛋白結(jié)合率 34.99±2.89 %相比具有極顯漿蛋白結(jié)合率和 Beagle犬血漿蛋白結(jié)合率之間具表 1-5 TPL 與不同種屬的血漿蛋白結(jié)合率（n=3， x s）

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