目的:研究通絡(luò)糖泰方對(duì)高糖原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞凋亡及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響,探索通絡(luò)糖泰方治療糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)的分子機(jī)制,為通絡(luò)糖泰方預(yù)防和治療DPN的機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:采用選新生的SD大鼠,取坐骨神經(jīng)干,原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞后進(jìn)行傳代,取第三代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的雪旺細(xì)胞作為研究對(duì)象。用50m M高糖培養(yǎng)72h,誘導(dǎo)DPN雪旺細(xì)胞模型。加入通絡(luò)糖泰含藥血清(4種濃度)培養(yǎng),分為6個(gè)組。細(xì)胞培養(yǎng)72h,通過Annexin-FITC/PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;通過透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。Western Blot法檢測(cè)活化Caspase-3,AKT、p-AKT在高糖環(huán)境培養(yǎng)雪旺細(xì)胞24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。采用RT-PCR法檢測(cè)凋亡調(diào)控因子Bax、Bcl-2、Bcl-x L m RNA的表達(dá)。研究通絡(luò)糖泰對(duì)高糖誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞凋亡的影響。并通過研究其對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響,以抑制雪旺細(xì)胞凋亡為研究方向探討通絡(luò)糖泰治療DPN的分子生物學(xué)機(jī)理。結(jié)果:1、Annexin-FITC/PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)凋亡率證實(shí)50m M高糖培養(yǎng)可導(dǎo)致雪旺細(xì)胞明顯凋亡,與對(duì)照組相比,高糖培養(yǎng)72小時(shí),高糖組的凋亡率明顯增加(p0.01);與高糖組相比,5%、10%濃度通絡(luò)糖泰含藥血清組的凋亡率顯著降低(p0.01)。2、透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu),培養(yǎng)72h,高糖組凋亡雪旺細(xì)胞增多,線粒體腫脹,線粒體嵴消失;含通絡(luò)糖泰血清組雪旺細(xì)胞損傷有改善,10%濃度含藥組更明顯。3、Western Blot結(jié)果提示,與對(duì)照組比較,培養(yǎng)24h、48h、72h高糖組活化Caspase-3表達(dá)明顯增加,差異具有顯著性(P0.01);與高糖組比較,不同濃度含藥血清組活化Caspase-3含量降低,其中培養(yǎng)48h、72h的5%、10%含藥血清組降低具有非常顯著性(P0.01)。與對(duì)照組相比,高糖組p-AKT表達(dá)明顯降低;與高糖組相比,培養(yǎng)24h、48h、72h的2.5%、5%、10%含藥血清組p-AKT蛋白表達(dá)量增高,差異具有顯著性(P0.01)。4、RT-PCR法測(cè)定結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,培養(yǎng)24h、48h、72h高糖組的bcl-2m RNA、Bcl-x Lm RNA表達(dá)量明顯減少(P0.01),培養(yǎng)24h、48h、72h高糖組的Baxm RNA表達(dá)量明顯增加,(P0.01);與高糖組相比,培養(yǎng)24h、48h、72h 5%、10%含藥血清組的bcl-2m RNA、Bcl-x Lm RNA表達(dá)量明顯增加(P0.01~0.05),培養(yǎng)48h、72h 5%、10%含藥血清組的Baxm RNA表達(dá)量明顯減少(P0.01)。結(jié)論:1、50m M高糖培養(yǎng)可導(dǎo)致雪旺細(xì)胞凋亡,干預(yù)72h后可引起明顯的細(xì)胞凋亡,高糖培養(yǎng)72h雪旺細(xì)胞細(xì)胞可以作為研究DPN的雪旺細(xì)胞模型。2、通絡(luò)糖泰含藥血清能明顯減少高糖誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞凋亡,減少凋亡程度與藥物濃度有關(guān),以5%濃度、10%濃度效果最佳。3、高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞可引起其PI3K/AKT信號(hào)通路活化抑制,通絡(luò)糖泰含藥血清能有效激活高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路。通絡(luò)糖泰含藥血清減少高糖誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與通絡(luò)糖泰含藥血清激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。
【學(xué)位單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5

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本文編號(hào)：2826091