背景抑郁癥具有情緒低落、興趣喪失和快感缺失三大核心癥狀,同時(shí)還伴有焦慮、自罪自責(zé)、精神病性癥狀、自殺傾向、睡眠障礙、食欲紊亂等。世界衛(wèi)生組織有關(guān)全球疾病總負(fù)擔(dān)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,預(yù)計(jì)至2020年抑郁癥的疾病負(fù)擔(dān)將升至第2位。慢性應(yīng)激可以誘導(dǎo)包括抑郁癥在內(nèi)的心境障礙,但是,在遭受同樣應(yīng)激的條件下,還有相當(dāng)一部分個(gè)體并未發(fā)生抑郁等心境障礙。實(shí)驗(yàn)研究也已證明,動(dòng)物對(duì)慢性應(yīng)激的敏感性也存在顯著差異。經(jīng)歷一定程度應(yīng)激后未發(fā)生抑郁等心境障礙的現(xiàn)象被認(rèn)為是應(yīng)激抵抗,這些個(gè)體被認(rèn)為擁有避免應(yīng)激對(duì)自身狀態(tài)造成不良影響一種能力,即應(yīng)激抵抗力。在過(guò)去的10多年中,抵抗力受到大量研究的關(guān)注。一些研究已經(jīng)證明,抵抗力的具備不僅僅是因?yàn)槿鄙倭四切┐嬖谟趹?yīng)激易感者中的不良改變,更重要的可能是因?yàn)樵诘挚箓�(gè)體中存在著使他們應(yīng)變能力增強(qiáng)的關(guān)鍵性分子的改變,但是其潛在的機(jī)制并不清楚。因此抑郁和應(yīng)激抵抗個(gè)體的腦蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯得尤為重要。目的研究慢性不可預(yù)測(cè)溫和應(yīng)激(Chronic unpredicted mild stress,CUMS)誘導(dǎo)的大鼠的不同行為學(xué)表現(xiàn)及海馬內(nèi)不同變化。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析各組海馬組織,力圖發(fā)現(xiàn)與抑郁和應(yīng)激抵抗相關(guān)的差異蛋白及生物過(guò)程,揭示針對(duì)應(yīng)激發(fā)生不同反應(yīng)的可能的分子機(jī)制。方法選取8周齡的SD大鼠,每日隨機(jī)給予大鼠以下刺激中的2-3種,包括:禁食(24 h)、禁水(24 h),群居(每4-5只飼養(yǎng)在一個(gè)小鼠籠內(nèi),12 h)、傾斜鼠籠(16 h)、鼠籠環(huán)境潮濕(將200 ml的水倒入鼠籠)、白噪音刺激(85 dB,6 h)、空瓶子(2h)、熱刺激(45 ℃,15 min)、冷刺激(4 ℃,2 h)、持續(xù)光照(12 h)和閃光燈刺激(200 Hz,4 h),持續(xù)7周。刺激前后均用糖水偏好實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠的行為狀態(tài)。根據(jù)行為學(xué)表現(xiàn),應(yīng)激后分為三組,正常對(duì)照組、應(yīng)激抵抗組、應(yīng)激敏感組(即抑郁組)。采用尼氏染色和高爾基染色分別檢測(cè)海馬神經(jīng)元的數(shù)目和海馬神經(jīng)元的樹(shù)突棘。通過(guò)免疫組化方法研究小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài),并進(jìn)行體視學(xué)分析。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定海馬內(nèi)促炎因子的水平。檢測(cè)海馬組織脂質(zhì)氧化指標(biāo)(丙二醛)和抗氧化酶(超氧化物歧化酶)的水平和活性。采用基于iTRAQ技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析各組海馬組織,篩選出差異表達(dá)蛋白;對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物學(xué)分析:GO注釋及GO富集分析,尋找與差異表達(dá)蛋白顯著相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。然后采用免疫印跡、免疫組織化學(xué)、免疫熒光的方法對(duì)相關(guān)蛋白及生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行驗(yàn)證及進(jìn)一步深入研究。結(jié)果1.抑郁組的大鼠糖水消耗百分比下降到45%,而對(duì)照組和應(yīng)激抵抗組仍為80%以上;抑郁組的大鼠在水中靜止不動(dòng)的時(shí)間為220 s,明顯高于對(duì)照組的78 s和應(yīng)激抵抗組的82 s;抑郁組大鼠5 min內(nèi)穿越的格子數(shù)目約30個(gè),這明顯低于對(duì)照組的149個(gè)和應(yīng)激抵抗組的138個(gè),抑郁組大鼠的雙上肢垂直上抬的次數(shù)下降至8次,少于對(duì)照組的27和應(yīng)激抵抗組的26;以上結(jié)果,抑郁組大鼠表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為,但是應(yīng)激抵抗組大鼠并未表現(xiàn)出抑郁樣行為。2.尼氏染色結(jié)果顯示抑郁組海馬CA1、CA3、DG區(qū)神經(jīng)元面積較對(duì)照組均下降30%左右,而應(yīng)激抵抗組與對(duì)照組相比沒(méi)有差異。海馬樹(shù)突棘研究結(jié)果顯示,抑郁組大鼠海馬CA1區(qū)的樹(shù)突棘和成熟的蘑菇型樹(shù)突棘分別為4.3個(gè)/10 μm、1.7個(gè)/50 μm,對(duì)照組的分別為10.7個(gè)/10 μm、6.7個(gè)/50 μm,應(yīng)激抵抗組分別為10個(gè)/10 μm、6.3個(gè)/50μm,表明抑郁組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目及其樹(shù)突棘數(shù)目下降,應(yīng)激抵抗組沒(méi)有發(fā)生神經(jīng)元及其樹(shù)突棘的丟失。3.小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究結(jié)果顯示,抑郁組海馬區(qū)三種狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞所占百分比分別為靜息態(tài)16.4%、中間態(tài)35.2%、激活態(tài)48.4%,對(duì)照組則分別為靜息態(tài)68.7%、中間態(tài)24.3%、激活態(tài)7%,而應(yīng)激抵抗組為靜息態(tài)45.2%、中間態(tài)45.8%、激活態(tài)9%。抑郁組海馬區(qū)處于激活態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞高于另外兩組,而應(yīng)激抵抗組的海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞更多的是處于中間態(tài)。4.ELISA結(jié)果顯示,對(duì)照組海馬IL-1β、TNF-a的水平分別為50.8 pg/mg蛋白,26.2 pg/mg蛋白,應(yīng)激抵抗組分別為48.7 pg/mg蛋白,24.1 pg/mg蛋白,抑郁組分別為108.4 pg/mg蛋白,56.4 pg/mg蛋白,明顯高于對(duì)照組和應(yīng)激抵抗組。5.氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組海馬丙二醛的水平為0.41 nmol/mg蛋白,應(yīng)激抵抗組為0.37 nmol/mg蛋白,抑郁組為0.76 nmol/mg蛋白,明顯高于對(duì)照組和應(yīng)激抵抗組;對(duì)照組海馬超氧化物歧化酶的活性為100.8 U/mg蛋白,應(yīng)激抵抗組為151.2 U/mg蛋白,高于對(duì)照組,抑郁組為62.5 U/mg蛋白,明顯低于對(duì)照組和應(yīng)激抵抗組。6.iTRAQ技術(shù)總共檢測(cè)到4690個(gè)蛋白,并對(duì)3645個(gè)蛋白進(jìn)行了定量分析。按照差異表達(dá)條件(比值1.2或0.83,且p0.05)篩選到了 164個(gè)蛋白,其中,抑郁組與對(duì)照組相比,上調(diào)20個(gè),下調(diào)12個(gè);應(yīng)激抵抗組與對(duì)照組相比,上調(diào)21個(gè),下調(diào)43個(gè);應(yīng)激抵抗組與抑郁組相比,上調(diào)12個(gè),下調(diào)46個(gè)。通過(guò)對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)在抑郁組與對(duì)照組,上調(diào)蛋白參與的生物過(guò)程主要富集在炎癥過(guò)程、物質(zhì)和能量代謝、對(duì)應(yīng)激的反應(yīng),下調(diào)蛋白參與的生物過(guò)程主要富集在突觸可塑性、離子平衡、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn);在應(yīng)激抵抗組與對(duì)照組,上調(diào)蛋白參與的生物過(guò)程主要富集在對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)、信號(hào)通路、物質(zhì)和能量代謝、突觸可塑性,下調(diào)蛋白參與的生物過(guò)程主要富集在炎癥過(guò)程、對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)、物質(zhì)和能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn);在應(yīng)激抵抗組與抑郁組,上調(diào)蛋白參與的生物過(guò)程主要富集在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、突觸可塑性、對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)、發(fā)育過(guò)程、物質(zhì)和能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),下調(diào)蛋白參與的生物過(guò)程主要富集在炎癥過(guò)程、對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)、信號(hào)通路等。7.免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明,與對(duì)照組相比,抑郁組大鼠海馬mGluR1,mGluR2,NR1的水平明顯下降,tau蛋白在絲氨酸396位點(diǎn)(pS396)的磷酸化水平上升了 37%,在絲氨酸404位點(diǎn)(pS404)的磷酸化水平上升了 127%,在蘇氨酸(pT205)的磷酸化水平上升了 75%。8.免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,抑郁組大鼠海馬EAAT2水平下降了37%,應(yīng)激抵抗組上升了 33%。9.免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,抑郁組大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性降低,應(yīng)激抵抗組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性升高。10.抑郁組Nrf2的激活形式表達(dá)量明顯下降,且少有進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用,而在應(yīng)激抵抗組海馬Nrf2的激活形式表達(dá)量明顯增加,且更多的入核發(fā)揮作用。11.抑郁組ERK在蘇氨酸202/204位點(diǎn)(p-ERK,Thr202/204)的磷酸化水平降低44%,在應(yīng)激抵抗組升高390%,抑郁組AKT在絲氨酸473位點(diǎn)(p-AKT,Ser473)的磷酸化水平降低71%,在應(yīng)激抵抗組升高47%。結(jié)論CUMS后,抑郁組的大鼠海馬內(nèi)許多蛋白水平發(fā)生異常變化,這些蛋白的異常變化可能介導(dǎo)了突觸可塑性、炎癥過(guò)程、氧化應(yīng)激、信號(hào)通路、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)生物學(xué)過(guò)程的異常,使海馬內(nèi)出現(xiàn)顯著的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng),從而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元數(shù)目及其樹(shù)突棘數(shù)目下降、星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性降低等,最終引起抑郁樣行為的發(fā)生。CUMS后,應(yīng)激抵抗的大鼠海馬內(nèi)同樣存在一些蛋白水平發(fā)生變化,這些蛋白可能參與了一系列的生物過(guò)程的調(diào)控,比如增強(qiáng)氧化磷酸化作用及抗氧化應(yīng)激能力,使得星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性增強(qiáng),炎癥反應(yīng)受到抑制,神經(jīng)元未發(fā)生異常病變,從而成功抵制了抑郁樣行為的發(fā)生。背景抑郁癥是心境障礙的一種,以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征,且反復(fù)發(fā)作。盡管抑郁癥的發(fā)病機(jī)制還不明確,但大量研究表明炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)在抑郁癥的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。氧化應(yīng)激與炎癥之間在多個(gè)層面相互作用相互影響,共同導(dǎo)致病變的發(fā)生發(fā)展。因此尋找一種同時(shí)擁有抗氧化和抗炎作用的藥物治療抑郁癥十分必要。目的研究大黃素對(duì)于慢性不可預(yù)測(cè)溫和應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為的治療作用,并探索其作用機(jī)制。 '方法采用CUMS制造抑郁模型,5周后通過(guò)糖水偏好實(shí)驗(yàn)篩選出有抑郁傾向的大鼠,然后給予大黃素灌胃治療兩周,每日劑量為80mg/kg,給藥的過(guò)程中應(yīng)激同前,兩周之后,對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè),評(píng)價(jià)其抑郁狀態(tài)。采用尼氏染色檢測(cè)海馬yL經(jīng)元,采用高爾基染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元的樹(shù)突棘。通過(guò)免疫組化檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,并進(jìn)行體視學(xué)分析。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定海馬內(nèi)促炎因子的水平,檢測(cè)海馬組織脂質(zhì)氧化指標(biāo)MDA和抗氧化酶(SOD)的水平和活性。采用免疫印跡、免疫組化、免疫熒光實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Nrf2及其磷酸化水平變化,檢測(cè)GSK3P,PI3K/AKT的變化,檢測(cè)5-L0的水平變化。采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)miR495,miR139-5p,miR135-5p,miR126-3p的水平變化。結(jié)果1.大黃素千預(yù)的抑郁傾向組糖水消耗百分比為78.5%,較載體千預(yù)的抑郁傾向組明顯升高,且與正常對(duì)照組相比沒(méi)有差異。大黃素干預(yù)的抑郁傾向組在水中靜止不動(dòng)的時(shí)間為79 s,明顯低于載體干預(yù)的抑郁傾向組的206 s,且與正常對(duì)照組相比沒(méi)有差異。大黃素干預(yù)的抑郁傾向組大鼠5 min內(nèi)穿越的格子數(shù)目約124個(gè),這明顯高于載體千預(yù)的抑郁傾向組25個(gè),且與正常對(duì)照組相比沒(méi)有差異;同時(shí)大黃素干預(yù)的抑郁傾向組大鼠的雙上肢垂直上抬的次數(shù)為約22次,這明顯高于載體干預(yù)的抑郁傾向組的8次,且與正常對(duì)照組對(duì)比沒(méi)有差異。2.尼氏染色結(jié)果顯示,與載體干預(yù)的抑郁傾向組相比,大黃素干預(yù)的抑郁傾向組的海馬CA1、CA3、DG區(qū)神經(jīng)元面積分別增加了25%、19%、22%,且均與正常對(duì)照組對(duì)比無(wú)差異。高爾基染色結(jié)果顯示,大黃素干預(yù)的抑郁傾向組的海馬CA1區(qū)的樹(shù)突棘和成熟的蘑菇型樹(shù)突棘分別為8.3個(gè)/10 pm、4個(gè)/50μm,明顯高于載體干預(yù)的抑郁傾向組的4.3個(gè)/10 pm、2個(gè)/50μm,但仍均低于正常對(duì)照組。3.小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究結(jié)果顯示,載體干預(yù)的抑郁傾向組海馬區(qū)三種狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞所占百分比分別為靜息態(tài)16.4%、中間態(tài)35.2%、激活態(tài)48.4%,而大黃素干預(yù)的抑郁傾向組的分別為靜息態(tài)56.6%、中間態(tài)28.8%、激活態(tài)14.6%,可見(jiàn)大黃素干預(yù)后可明顯升高靜息態(tài)的比例和降低激活態(tài)的比例,但其中間態(tài)的比例仍高于正常對(duì)照組。4.ELISA結(jié)果顯示,載體干預(yù)的抑郁傾向組海馬IL-1β、TNF-α的水平分別為110.1 pg/mg蛋白,55.1 pg/mg蛋白,而大黃素將其分別降低到60.5 pg/mg蛋白、32.9pg/mg蛋白,這表明大黃素可以明顯降低慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬炎癥因子水平的升高。氧化應(yīng)激指標(biāo)顯示,大黃素干預(yù)的抑郁傾向組的海馬組織的MDA水平為0.39nmol/mg蛋白,SOD活性為90.7 U/mg蛋白,而載體干預(yù)的抑郁傾向組分別為0.73nmol/mg蛋白,61.2U/mg蛋白,表明大黃素可以有效改善氧化與抗氧化之間的失衡。5.免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與載體干預(yù)的抑郁傾向組相比,大黃素干預(yù)的抑郁傾向組海馬全細(xì)胞p-Nrf2水平升高了157%,且比正常對(duì)照組也升高了100%。成分蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,正常情況下,t-Nrf2在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均有分布,而p-Nrf2幾乎全部分布在細(xì)胞核中。慢性應(yīng)激后,載體干預(yù)的抑郁傾向組海馬組織的細(xì)胞漿內(nèi)的t-Nr￡2水平升高,細(xì)胞核內(nèi)的t-Nrf2水平降低,而大黃素干預(yù)后可使細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)的t-Nrf2均恢復(fù)到正常水平,同時(shí)p-Nrf2在載體干預(yù)的抑郁傾向組細(xì)胞核內(nèi)水平明顯下降,而大黃素干預(yù)后,不僅可以增加細(xì)胞核內(nèi)p-Nrf2水平,且高于正常對(duì)照組。同時(shí),腦片免疫組化染色結(jié)果顯示,大黃素干預(yù)后P-Nrf2在海馬CA1,CA3,DG區(qū)的表達(dá)f堅(jiān)黽

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