類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜病變?yōu)橹鞯拿庖呦到y(tǒng)疾病,目前臨床上尚不能有效根治�？乖蕾囆訡D4~+T淋巴細(xì)胞的過度活化增殖和極化偏移被認(rèn)為是RA發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),通過調(diào)節(jié)體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞或Th17/Treg細(xì)胞的平衡可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài),并實現(xiàn)對RA的發(fā)病及病情惡化的控制。鉤吻素子是中國鉤吻生物堿單體中含量最高的一種有效成分,課題組前期工作在鉤吻素子抗RA及其作用機(jī)制的研究中,在整體動物水平發(fā)現(xiàn)鉤吻素子可顯著抑制RA模型動物脾臟Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞及血清相關(guān)細(xì)胞因子的異常升高,提示其對Th細(xì)胞的極化偏移可能具有調(diào)節(jié)作用,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),鉤吻素子對Th細(xì)胞極化偏移起始階段免疫細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用,但其對Th細(xì)胞極化偏移調(diào)節(jié)作用還需要進(jìn)一步研究確證,其作用機(jī)制尤其是作用靶點和作用方式還不明確,有待于深入研究探索。此外,課題組前期研究發(fā)現(xiàn),線粒體18 kDa轉(zhuǎn)位蛋白(TSPO)是鉤吻素子重要的體內(nèi)作用靶點,但其是否有鉤吻素子抗RA效應(yīng)有關(guān)以及其在Th細(xì)胞極化偏移時的表達(dá)情況尚不明確。鑒此,本文首先在原代培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞中探明鉤吻素子對T細(xì)胞活化增殖及細(xì)胞周期的影響,進(jìn)而在離體細(xì)胞水平驗證鉤吻素子對Th細(xì)胞極化偏移的調(diào)節(jié)作用,最后觀察TSPO在Th細(xì)胞極化偏移時的表達(dá)情況以及鉤吻素子對其表達(dá)的影響。本研究將有助于進(jìn)一步闡明鉤吻素子治療RA的分子機(jī)制,為鉤吻素子有望開發(fā)為治療RA新藥提供依據(jù)。1鉤吻素子對小鼠T細(xì)胞活化增殖的抑制作用1.1鉤吻素子對混合淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖的抑制作用制備健康BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞懸液,使用絲裂霉素C處理作為供體刺激細(xì)胞,同時制備健康C57BL/6小鼠脾臟細(xì)胞懸液作為受體應(yīng)答細(xì)胞,在此基礎(chǔ)上給予鉤吻素子(4、0.8、0.16、0.032 mmol/L)共培養(yǎng)48 h,觀察其對混合培養(yǎng)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用,結(jié)果顯示鉤吻素子可呈濃度依賴性抑制混合培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的增殖,IC_(50)為1.448 mmol/L。1.2鉤吻素子對抗CD3/CD28抗體誘導(dǎo)小鼠初始T細(xì)胞增殖的抑制作用為觀察鉤吻素子對T細(xì)胞受體(TCR)交聯(lián)誘導(dǎo)的初始T細(xì)胞增殖是否具有抑制作用,以競爭性TCR抗體刺激T細(xì)胞模擬TCR/CD3+CD28共刺激信號誘導(dǎo)初始T細(xì)胞活化。提取正常BALB/c小鼠脾細(xì)胞并以免疫磁珠純化獲得初始T細(xì)胞,與抗CD3及抗CD28抗體共培養(yǎng)96 h后,加入梯度濃度的鉤吻素子(15、3、0.6、0.12、0.024、0.0048 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h,以BrdU摻入法檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果提示抗CD3+抗CD28抗體可有效誘導(dǎo)初始T細(xì)胞增殖;鉤吻素子可顯著抑制抗CD3+抗CD28抗體誘導(dǎo)的初始T細(xì)胞增殖,作用呈劑量依賴性IC_(50)為3.253 mmol/L,與鉤吻素子對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)抑制作用的IC_(50)水平均接近鉤吻素子細(xì)胞毒性水平,綜合二者表現(xiàn),提示鉤吻素子對T細(xì)胞活化的第1信號與第2信號具有一定抑制作用,但其作用較弱,可能不是鉤吻素子抑制T細(xì)胞活化增殖的主要作用環(huán)節(jié)。1.3鉤吻素子對伴刀豆蛋白A(Con A)誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用為進(jìn)一步探明鉤吻素子對Con A誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用,制備正常BALB/c小鼠脾細(xì)胞懸液,利用熒光染料CFSE處理后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入Con A誘導(dǎo)細(xì)胞增殖,同時加入梯度濃度的鉤吻素子(5000、1250、312.5、78.125、19.531、4.883μmol/mL)共培養(yǎng)48 h,以熒光標(biāo)記的抗CD3 APC抗體標(biāo)記后,流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光信號。在Con A誘導(dǎo)增殖的小鼠脾細(xì)胞中給予鉤吻素子處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著鉤吻素子劑量增加,CFSE法檢測獲得的熒光信號圖中增殖峰的數(shù)量逐漸減少,提示鉤吻素子可顯著抑制Con A誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞細(xì)胞增殖,與課題組前期以BrdU摻入法檢測鉤吻素子對Con A誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果相一致。1.4鉤吻素子對Con A誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖周期的影響制備BALB/c小鼠脾細(xì)胞懸液以Con A誘導(dǎo)增殖,同時給予梯度濃度的鉤吻素子(93.75、187.5、375μmol/L)共培養(yǎng)48 h后PI染色,流式細(xì)胞儀檢測。肉眼觀察各處理組G0/G1期信號峰形狀相似,而S期信號峰則出現(xiàn)隨著鉤吻素子濃度增加而上抬的趨勢,G2/M期信號峰的變化趨勢則與之相反。根據(jù)細(xì)胞周期G0/G1-S-G2/M期進(jìn)程中各期細(xì)胞相對數(shù)量的改變,上述結(jié)果提示鉤吻素子可呈濃度依賴性阻滯Con A誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期進(jìn)程,使其阻滯于S期。2鉤吻素子對離體水平誘導(dǎo)Th細(xì)胞極化偏移的調(diào)節(jié)作用制備小鼠脾懸液,在體外與Con A共培養(yǎng),同時加入梯度濃度的鉤吻素子(20000、5000、1250、312.5、78.125、19.531、4.883μg/mL),連續(xù)培養(yǎng)48 h后,用BD公司的小鼠Th1/Th2/Th17 CBA試劑盒處理,流式細(xì)胞儀FACSVerse檢測,FCAP軟件數(shù)據(jù)讀取,根據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線,將檢測結(jié)果代入換算獲得炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平。結(jié)果顯示與對照組比較,模型組IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-4的信號出現(xiàn)向右偏移,提示在Con A誘導(dǎo)下IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-4出現(xiàn)高表達(dá)趨勢。而鉤吻素子處理組與模型組比較,其信號偏移隨著鉤吻素子濃度增大而呈現(xiàn)不同程度恢復(fù)性改變。將測得值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得各組細(xì)胞因子表達(dá)水平,鉤吻素子對Con A誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞IL-17A、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-4、IL-10及IL-2細(xì)胞因子表達(dá)水平的改變均呈現(xiàn)不同程度抑制效應(yīng)。鉤吻素子對模型組IFN-γ/IL-4比值的升高具有顯著抑制作用,提示其對離體水平誘導(dǎo)的Th1/Th2細(xì)胞的極化偏移具有調(diào)節(jié)作用。鉤吻素子可顯著降低模型組細(xì)胞IL-17A的表達(dá)水平,提示其可抑制Th0細(xì)胞向Th17細(xì)胞的極化,以IL-17A/IL-10比值衡量Th17/Treg細(xì)胞相對關(guān)系,鉤吻素子亦可顯著抑制模型組IL-17A/IL-10比值的升高,提示鉤吻素子對離體水平誘導(dǎo)Th17/Treg細(xì)胞的極化偏移也具有調(diào)節(jié)作用。此外,鉤吻素子對Con A誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞促炎細(xì)胞因子TNF-α及IL-6表達(dá)水平的升高也呈現(xiàn)顯著抑制作用。而在Con A模型組表達(dá)水平降低的IL-10與IL-2,給予鉤吻素子處理后,高濃度鉤吻素子處理組IL-10(1.25-20 mmol/L鉤吻素子)與IL-2(0.3125-20 mmol/L鉤吻素子)水平均未呈現(xiàn)顯著性改變,與Con A模型組比較均無顯著性差異,但低濃度鉤吻素子處理組可顯著升高IL-10(4.88-312.5μmol/L鉤吻素子)與IL-2(4.88-78.13μmol/L鉤吻素子)的表達(dá)。因此綜合課題組前期在整體動物水平觀察到的實驗結(jié)果,可確證鉤吻素子對Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞極化偏移具有顯著調(diào)節(jié)作用,可恢復(fù)RA發(fā)病時Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞亞群及其下游致炎/抗炎細(xì)胞因子之間的平衡狀態(tài)而發(fā)揮對RA的治療效應(yīng)。3鉤吻素子處理下調(diào)TSPO在Th細(xì)胞極化偏移時的表達(dá)制備小鼠脾細(xì)胞懸液,接種于含Con A及10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,在接種時分別給予終濃度為500、50μmol/L鉤吻素子處理,同時設(shè)置培養(yǎng)液僅含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基為對照組和不含血清RPMI 1640培養(yǎng)基的空白組,經(jīng)過48 h連續(xù)培養(yǎng)后提取各組細(xì)胞總蛋白。結(jié)果顯示,接種于含10%血清RPMI 1640培養(yǎng)基中的小鼠脾細(xì)胞TSPO表達(dá)水平顯著高于空白組,而Con A誘導(dǎo)模型組TSPO的表達(dá)量則出現(xiàn)進(jìn)一步的升高,顯著高于空白組和對照組。Con A模型鉤吻素子處理組脾細(xì)胞β-actin蛋白表達(dá)水平與其他組接近,而TSPO表達(dá)水平則均出現(xiàn)顯著性抑制,顯著低于Con A模型組和對照組。提示TSPO在Th細(xì)胞極化偏移時高表達(dá),鉤吻素子處理后其表達(dá)水平下調(diào),該結(jié)果支持鉤吻素子的抗炎效應(yīng),但鉤吻素子在調(diào)節(jié)Th細(xì)胞極化時TSPO表達(dá)的下調(diào)究竟來源于鉤吻素子的直接作用還是繼發(fā)于鉤吻素子抗炎作用,還需要進(jìn)一步研究闡明。上述結(jié)果提示1.鉤吻素子對免疫細(xì)胞的活化增殖具有顯著抑制作用,可使細(xì)胞周期停滯于S期,其對抗原依賴性T細(xì)胞活化起始階段TCR識別抗原的第1信號與第2信號也具有一定抑制作用;2.鉤吻素子對Th細(xì)胞極化偏移具有顯著調(diào)節(jié)作用,可恢復(fù)Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞亞群及其下游致炎/抗炎細(xì)胞因子之間的平衡狀態(tài);3.鉤吻素子在Th細(xì)胞極化偏移時可使TSPO表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

1 抗原依賴性 T 細(xì)胞活化需要的 3 種信號（圖片引自參考文獻(xiàn)[1床上治療 RA 仍以藥物治療為主，抗 RA 治療藥物主要包括非non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs）、改善病情的抗modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs）、糖皮質(zhì)激素、生物制中針對 RA 發(fā)病過程中過度活躍的致炎性介質(zhì)而發(fā)揮療效的靶 藥物治療的一個里程碑，它已被證明較傳統(tǒng)藥物在緩解癥狀及好的效果，包括 TNF-α抑制劑（如依那西普、英夫利昔、阿達(dá)木胞的生物制劑（阿巴西普）、靶向 B 細(xì)胞的生物制劑（利妥昔單（托珠單抗）等[15]。盡管新型抗 RA 藥物療效較過去取得了顯著價格昂貴、會導(dǎo)致感染加重及誘發(fā)惡性腫瘤的風(fēng)險等，使其應(yīng)6, 17]。因此，安全有效抗 RA 藥物具有重大需求。物是新藥研發(fā)的重要來源。鉤吻（Gelsemium elegans Benth.）是用植物，1887 年 Gerrad H 等將其制成格林制劑，為一些國家副

小鼠脾細(xì)胞活性證制備的小鼠脾細(xì)胞的活性狀態(tài)，以 T 細(xì)胞表面活性標(biāo)識 CD備健康小鼠脾細(xì)胞懸液后接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板并給予刺激in。培養(yǎng)后收集細(xì)胞以熒光標(biāo)記的抗 CD4 和 CD69 抗體標(biāo)記，流 CD4+T 細(xì)胞表面 CD69 分子的表達(dá)情況。如圖 1 所示，根據(jù) FS少數(shù)細(xì)胞碎片分散在顯示圖邊緣，脾細(xì)胞明顯分為兩群，根據(jù)的物理性質(zhì)，其主要為密度大小均勻的一簇長橢圓狀的細(xì)胞群，門為淋巴細(xì)胞，占脾細(xì)胞的 52.8 %；門內(nèi)的淋巴細(xì)胞根據(jù)抗 CD表達(dá)情況，分為表達(dá)熒光的 CD4+T 細(xì)胞和不表達(dá)熒光的 CD4-T圈門內(nèi)即為 CD4+T 細(xì)胞，占淋巴細(xì)胞百分比的 42.5 %；在 FL細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用熒光抗體抗 CD69 PE，以“十”字門區(qū)分 CD69-PE 陽性、雙陰性、雙陽性細(xì)胞，可知 CD69+CD4+T 細(xì)胞為 9后續(xù)實驗要求。

子對混合培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖抑制作用的 IC50為 1.448 mmol/L（95 %可信區(qū)間為 0.7974~2.628 mmol/L；圖3B）。圖 2 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2825788