發(fā)布時(shí)間：2020-09-24 10:31

　　 本研究采用基于核磁共振(~1H-NMR)和氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(GC-TOFMS)的代謝組學(xué)研究技術(shù),并使用16S rRNA高通量測(cè)序法的腸道菌群技術(shù)對(duì)黃獨(dú)素B誘導(dǎo)小鼠肝損傷進(jìn)行研究,從代謝網(wǎng)絡(luò)和腸道菌群角度探討黃獨(dú)素B誘導(dǎo)小鼠肝損傷作用機(jī)制,為黃藥子的毒性研究提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容如下:第一部分黃獨(dú)素B毒性評(píng)價(jià)將小鼠分為黃獨(dú)素B組與正常組,黃獨(dú)素B組連續(xù)灌胃給藥黃獨(dú)素B混懸液(150 mg/kg,給藥前以0.5%CMC-Na溶液制成10mg/mL的混懸液)14d,正常組小鼠灌胃等體積0.5%CMC-Na溶液,末次給藥24 h后,檢測(cè)小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平和肝組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;采用蘇木精-伊紅染色法觀察肝組織病理學(xué)變化。結(jié)果顯示:(1)與正常組對(duì)比,黃獨(dú)素B組小鼠血清ALT、AST及肝組織MDA水平升高,肝組織SOD水平下降。(2)正常組小鼠肝組織細(xì)胞邊界清晰、排列整齊、形態(tài)正常,均未見組織病理學(xué)異常;黃獨(dú)素B組小鼠肝組織細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性,部分細(xì)胞出現(xiàn)水腫,肝組織病理學(xué)改變較明顯。第二部分基于~1H-NMR技術(shù)的黃獨(dú)素B誘導(dǎo)小鼠肝損傷的代謝組學(xué)研究將小鼠尿液、糞便和肝臟樣本進(jìn)行代謝組學(xué)技術(shù)前處理,使用~1H-NMR技術(shù)測(cè)定代謝物輪廓;采用正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal Partial Least-Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)研究黃獨(dú)素B誘導(dǎo)小鼠肝損傷代謝表型變化;運(yùn)用變量重要性投影(Variable Importance in the Projection,VIP)和t檢驗(yàn)篩選潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果表明:(1)黃獨(dú)素B能引起的小鼠尿液、糞便和肝臟代謝表型紊亂,表現(xiàn)為尿液中篩選出8個(gè)生物標(biāo)志物(丙酮、丙酮酸、α-酮戊二酸、�；撬�、甘氨酸、苯乙酰甘氨酸、馬尿酸、吲哚硫酸酯)、糞便中篩選出9個(gè)生物標(biāo)志物(膽汁酸、丙酸、谷氨酰胺、乳酸、蘇氨酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、酪氨酸、苯丙氨酸),肝臟中篩選出7個(gè)生物標(biāo)志物(異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、乙酸、谷氨酸、膽堿)。(2)黃獨(dú)素B誘導(dǎo)小鼠肝損傷主要涉及四個(gè)方面:三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、腸道菌群代謝、神經(jīng)系統(tǒng)異常。第三部分基于GC-TOFMS技術(shù)的黃獨(dú)素B誘導(dǎo)小鼠肝損傷的代謝組學(xué)研究利用GC-TOFMS技術(shù)測(cè)定小鼠血清代謝物輪廓;采用OPLS-DA研究黃獨(dú)素B誘導(dǎo)小鼠肝損傷引起的代謝表型變化;通過VIP和t檢驗(yàn)對(duì)與黃獨(dú)素B誘導(dǎo)小鼠肝損傷相關(guān)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行篩選。結(jié)果表明:(1)篩選出7個(gè)與黃獨(dú)素B誘導(dǎo)小鼠肝損傷相關(guān)的潛在標(biāo)志物(α-酮異戊酸、尿囊素、亞�；撬�、己酸、D-蘇糖醇、蔗糖、戊二酸)(2)黃獨(dú)素誘導(dǎo)小鼠肝損傷可能與能量代謝異常、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、腸道菌群代謝及氨基酸代謝相關(guān)。第四部分基于16S rRNA高通量測(cè)序的黃獨(dú)素B誘導(dǎo)小鼠肝損傷腸道菌群研究采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)小鼠糞便腸道菌群結(jié)構(gòu)與組成的變化進(jìn)行研究。使用雙末端測(cè)序(Paired-End)法進(jìn)行小片段文庫(kù)的構(gòu)建,Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序;拼接過濾Reads后進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類,并利用分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋及豐度分析;通過PCoA及LEfSe分析對(duì)潛在菌群標(biāo)志物進(jìn)行判別。結(jié)果表明:(1)黃獨(dú)素B能引起小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。(2)門、科及屬水平總共篩選出11種潛在菌群標(biāo)志物,提示黃獨(dú)素肝損傷機(jī)制與短鏈脂肪酸代謝,膽汁酸代謝及膽汁酸重吸收有關(guān)。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.1
【部分圖文】：

A.正常組 B.黃獨(dú)素 B 組圖 2-1 小鼠肝臟組織病理學(xué)顯微鏡圖（HE 染色，×200）Fig 2-1 Photomicrographs of H&E- stained liver tissue from mice（HE，×200）2.4.2 黃獨(dú)素 B 對(duì)小鼠血清和肝臟生化指標(biāo)影響結(jié)果如表 2-2 所示，與正常組比較，黃獨(dú)素 B 組小鼠血清 ALT、AST 水平和肝臟 MDA 水平顯著上升，肝臟 SOD 水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明黃獨(dú)素 B 可造成小鼠肝臟損傷。表 2-2 小鼠血清 ALT、AST 和肝臟 MDA、SOD 水平檢測(cè)結(jié)果（ x±s，n＝6）Table 2-2 Determination results ofALT, AST in serum and MDA, SOD in liver tissue of mice（ x±s，n＝6）組別血清 肝臟ALT(U/L) AST(U/L) MDA(nmol/mg prot) SOD(U/mg prot)正常組 26.33±3.54 38.14±2.36 3.87±0.53 138.89±7.28

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文組小鼠代謝圖譜差異的 OPLS-DA 結(jié)果見圖 3-4。由圖 3-4 可知，在各樣本中，PC1 維上黃獨(dú)素 B 組與正常組樣本點(diǎn)可以完全分開，表明黃獨(dú)素 B 引起小鼠肝損傷后機(jī)體代謝表型發(fā)生了明顯變化。

小鼠肝臟1H-NMR圖譜

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本文編號(hào)：2825620