目的:本實(shí)驗(yàn)致力于初步研究脂質(zhì)體姜黃素通過調(diào)控microRNA途徑影響乳腺癌細(xì)胞對阿霉素藥物的敏感性,并分析其可能的作用機(jī)制。以此為指導(dǎo)臨床使用姜黃素對抗人乳腺癌化療耐藥提供理論依據(jù)。方法:(1)利用脂質(zhì)體包封技術(shù)制備脂質(zhì)體姜黃素。(2)選擇不同濃度的脂質(zhì)體姜黃素(6.8,13.58,27μM),分別與用不同濃度阿霉素(490,98,19.6,3.92,0.784,0.1568μM)處理后的人乳腺癌耐阿霉素MCF-7/ADR細(xì)胞共孵育48小時后,利用MTT法測定不同濃度脂質(zhì)體姜黃素孵育下阿霉素對MCF-7/ADR細(xì)胞的抑制率和半數(shù)致死量(IC50),并且計(jì)算各組藥物的協(xié)同增效指數(shù)(CI)。(3)采用miRNA和mRNA微陣列分析在敏感株、耐藥株、經(jīng)脂質(zhì)體姜黃素處理的耐藥株中篩選出差異表達(dá)的微小RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA)。(4)通過生物信息學(xué)預(yù)測軟件預(yù)測差異表達(dá)的miRNA可能的靶基因,并與mRNA微陣列中差異表達(dá)的靶基因取交集。(5)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測對5個在3株細(xì)胞株中差異表達(dá)的miRNAs(hsa-miR-29b-1-5p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-6068,hsa-miR-6790-5p 和 hsamiR-4417)以及mRNAs(DDIT4,EPAS1,VEGFA,RPS14,DCDC2)進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。(6)選擇hsa-miR-29b-1-5p進(jìn)一步研究耐藥機(jī)制,轉(zhuǎn)染hsa-miR-29b-1-5p模擬物(mimics)和抑制物(inhibitors)對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后,采用MTT法檢測miR-29b-1-5p表達(dá)變化對乳腺癌細(xì)胞耐藥性的影響。(7)通過KEGG通路富集分析和PPI蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)分析可能參與阿霉素耐藥機(jī)制的信號通路及靶基因。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)SPSS 22.0軟件分析。各實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次,重復(fù)性好。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:(1)MTT法檢測結(jié)果顯示,阿霉素對經(jīng)過脂質(zhì)體姜黃素孵育后的人乳腺癌耐阿霉素MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50明顯下降,并且兩者對細(xì)胞抑制率有協(xié)同增效作用。(2)miRNA和mRNA芯片結(jié)果顯示,與耐藥株MCF-7/ADR細(xì)胞相比,miRNA和mRNA在親本MCF-7細(xì)胞和經(jīng)脂質(zhì)體姜黃素處理的MCF-7/ADR細(xì)胞中的表達(dá)差異明顯,共發(fā)現(xiàn)67個差異表達(dá)的miRNA和323個差異表達(dá)的mRNA。根據(jù)TargetScan,Pictar,MicroCosm和miRDB預(yù)測軟件預(yù)測表達(dá)差異的miRNA可能的靶基因,與mRNA芯片結(jié)果取交集后發(fā)現(xiàn)20個共同靶基因。(3)從差異表達(dá)的miRNA和mRNA中挑選了 5個miRNA和5個mRNA進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致。(4)與陰性對照相比,MCF-7/S細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29b-1-5p mimics后,其表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)明顯增加,細(xì)胞的IC50也明顯升高;將miR-29b-1-5p轉(zhuǎn)染至MCF-7/ADR細(xì)胞后,其表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)明顯降低,細(xì)胞的IC50也明顯下降;經(jīng)脂質(zhì)體姜黃素處理的MCF-7/ADR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29b-1-5p mimic后,miR-29b-1-5p在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯增加,并且細(xì)胞IC50較前明顯升高。(5)KEGG通路富集分析和PPI蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示MAPK、mTOR、PI3K-Akt、AMPK、TNF、Ras 等信號通路以及 PPARG,RRM2、SRSF1、EPAS1 等下游基因可能參與了人乳腺癌對阿霉素的耐藥機(jī)制。結(jié)論:(1)脂質(zhì)體姜黃素能在一定程度上逆轉(zhuǎn)人乳腺癌對阿霉素的耐藥性。(2)脂質(zhì)體姜黃素通過調(diào)控microRNA的表達(dá)來影響相關(guān)信號通路可能是其調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞對阿霉素藥物敏感性的其中一條重要分子途徑。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

邐Ｈ３ＣＯ逡逑Ｃｕｒｃｕｍｉｎ逡逑圖１－１姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)逡逑Ｃｅｌｌ邋ｃｙｔｏｐｌａｓｍ逡逑Ｎｕｃｅａｒ邐＾逡逑－Ｊ＾ｍｉＲＮＡ邋ｇｅｎｅ邋Ｃｅｌｌ邋ｎｕｃｌｅａＮＳｆ＊．邋ｅｘｐｏｒｔ＾＾邋＾邋＾逡逑}丫sE邐｜ｐｒ＝ｉｎｇ逡逑酸邐Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ／＼｜邐柳物＞？逡逑ａ邐Ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ逡逑％邐？邋Ｊ邐Ｃｅａｖａｇｅ／邋／／逡逑ｍＲＮＡ邐Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ｄｅｇａｒｄａｔｉｏｎ邋ｍＲＮＡ邋ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ逡逑圖１－２邋ｍｉＲＮＡ形成和調(diào)控基因表達(dá)過程的示意圖逡逑２．１姜黃素調(diào)ｍｉＲＮＡ的機(jī)制逡逑大量研究表明，姜黃素通過調(diào)控ｍｉＲＮＡ的表達(dá)發(fā)揮著有效的抗腫瘤作用。ｍｉＲ－２１作逡逑為一種促癌基因在人類多種腫瘤中表達(dá)，在結(jié)直腸癌中，姜黃素能通過轉(zhuǎn)錄活化物－ｌ（ＡＰ－ｌ）逡逑抑制ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１轉(zhuǎn)錄調(diào)控從而降低ｍｉＲ－２１的表達(dá)，ＡＰ－１與ｐｒｉ－ｍｉｒ－２１啟動子結(jié)合可增強(qiáng)逡逑啟動子的活性，進(jìn)而增強(qiáng)ｍｉＲ－２１表達(dá)。姜黃素不僅降低ｃ－Ｆｏｓ／ＡＰ－１以及ｐ－ｃ－Ｊｕｎ／ＡＰ－１和逡逑啟動子的結(jié)合，同時抑制了邋ｃ－Ｊｕｎ的激活［１Ｇ１］。此外，在前列腺癌中，ｐ６５ＮＦ－ｋＢ亞單位通逡逑過與ｍｉＲ－２１啟動子結(jié)合可以上調(diào)ｍｉＲ－２１的表達(dá)，姜黃素可作為ＮＦ－ｋＢ信號通絡(luò)的調(diào)節(jié)劑逡逑８逡逑

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中眾所周知的一類分子［１３５］。在黑色素瘤細(xì)胞中，ＨＭＧＡ２通過下調(diào)ｍｉＲ－２００ｂ的表達(dá)X椙垮義習(xí)┲⒌淖疲撲乜梢醞ü黽櫻恚椋遙常常獾謀澩鏌種葡赴ㄒ蘋頻募せ�，上淀d膩義希恚椋遙常常庵苯影邢虻骺兀齲停牽粒不蛞種坪諫亓齙那ㄒ疲郟保常叮保常罰藎ㄍ跡保矗�。哉浾J(rèn)侔┫赴校義轄撲匾部梢隕系鰨恚椋遙罰系韉模恚椋遙釩邢螄碌饗掠位潁櫻牛裕復(fù)傭災(zāi)檔鴕認(rèn)侔┫稿義習(xí)那窒芰Γ郟保常福蕁ｅ義希牛簦潁幔悖澹歟歟酰歟幔蟈危茫酰潁悖酰恚椋鑠澹恚礤義希牛媯猓猓常蓿蓿咤澹�，邋＿逦？邋ｉ，邋Ｕ．邋＇冲｜：｜邋１＾１邋ｉe鑠澹剩殄�！■堝＇e歟у澹恚礤澹摺鰣澹椋蓿椋媯幔椋殄澹保掊濉觶俊鰣危摺鰣澹椋殄澹瑁桑齲殄義

本文編號：2825337