目的:用高脂刺激H9c2細(xì)胞來模擬高脂誘導(dǎo)的脂毒性心肌細(xì)胞損傷,預(yù)處理姜黃素納米粒后觀察細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、凋亡狀態(tài)及細(xì)胞損傷相關(guān)形態(tài)學(xué)改變,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。探討姜黃素納米粒對心肌細(xì)胞脂毒性損傷的保護作用及其機制。方法:(1)建立高脂誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷模型:選擇濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L棕櫚酸(Palmitic Acid,PA)溶液來刺激H9c2心肌細(xì)胞,0.4 mmol/L PA刺激細(xì)胞,時間分別選擇12 h、24 h、48 h。篩選PA合適的濃度和刺激時間,由此來建立高脂誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷模型。(2)姜黃素納米粒(Curcumin Nanoparticles,Cur-NPs)對高脂誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護作用機制:培養(yǎng)皿中H9c2細(xì)胞生長至80%-90%時,用不同濃度Cur-NPs預(yù)處理2 h后給予PA 0.4 mmol/L刺激24 h,用MTT比色法來檢測各組細(xì)胞增殖情況。將細(xì)胞傳代成5組:正常對照組;PA 0.2 mmol/L組,PA 0.2 mmol/L+Cur-NPs 200μmol/L組;PA 0.4 mmol/L組,PA0.4 mmol/L+Cur-NPs 200μmol/L組。用Cur-NPs 200μmol/L預(yù)處理2 h后給予PA刺激24h,用活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)檢測試劑盒對各組細(xì)胞進(jìn)行活性氧的檢測;用Annexin V-FITC/PI和Tunel試劑盒檢測各組細(xì)胞凋亡情況;用免疫印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白(GRP78、CHOP、ATF-4、P-IRE1)和凋亡信號通路相關(guān)蛋白(Bcl-2、BAX、caspase-3)的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)濃度為0.4 mmol/L的PA刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h時,細(xì)胞增殖率明顯降低,給予Cur-NPs(200μmol/L)預(yù)處理后,PA+Cur-NPs組與PA模型組相比細(xì)胞增殖率有所回升。(2)PA刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h時,ROS水平出現(xiàn)明顯升高,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變,比如細(xì)胞體積縮小,連接減少,數(shù)量減少,核質(zhì)濃縮,核膜核仁破碎等。給予Cur-NPs(200μmol/L)預(yù)處理后,PA+Cur-NPs組與PA模型組相比,細(xì)胞恢復(fù)正常形態(tài),數(shù)目也接近于正常對照組。(3)PA刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h時,凋亡現(xiàn)象明顯增多,比如細(xì)胞數(shù)目有所減少,細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)改變(核固縮、核碎裂、包膜破裂、細(xì)胞內(nèi)容物外溢等)。給予Cur-NPs(200μmol/L)預(yù)處理后,PA+Cur-NPs組與PA模型組相比,凋亡現(xiàn)象顯著減少,細(xì)胞數(shù)目與細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常,接近于正常對照組。(4)PA刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h時,ERS信號通路的相關(guān)蛋白(GRP78、CHOP、ATF-4、P-IRE1)以及caspase-3的表達(dá)增加,BAX/Bcl-2的比值升高;在Cur-NPs(200μmol/L)預(yù)處理后,ERS信號通路相關(guān)蛋白(GRP78、CHOP、ATF-4、P-IRE1)以及caspase-3的表達(dá)降低,BAX/Bcl-2的比值降低。結(jié)論:(1)H9c2給予PA刺激濃度為0.4 mmol/L、刺激時間為24 h時,能夠顯著的抑制細(xì)胞增殖,表明脂毒性心肌細(xì)胞損傷模型建立成功。(2)當(dāng)預(yù)處理Cur-NPs濃度為200μmol/L時,可以恢復(fù)高脂誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖率的損傷,減少細(xì)胞的凋亡,恢復(fù)細(xì)胞的正常形態(tài)。(3)當(dāng)預(yù)處理Cur-NPs濃度為200μmol/L時,能夠抑制高脂誘導(dǎo)的ERS信號通路和凋亡信號通路的激活。
【學(xué)位單位】：湖北科技學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1 不同濃度的 PA 刺激 24 h 細(xì)胞增殖情況PA 濃度分別為 0.1、0.2、0.4 和 0.8 mmol/L，。與正常對照組相比，PA 0.2 mmol/L 刺激顯下降（**P＜0.01），本次數(shù)據(jù)采用與 con

姜黃素納米粒對高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷后增殖的影響

圖 4 Cur-NPs 對高脂刺激的心肌細(xì)胞 ROS 損傷的影響（原始放大：20×）圖 4 結(jié)果表明，在 20 倍鏡下觀察，與正常對照組（control）比較，PA 濃度為 0.2mmol/L 時，細(xì)胞中 ROS 水平有所增加，細(xì)胞數(shù)目有所減少，另外細(xì)胞出現(xiàn)輕微形態(tài)學(xué)改變，例如細(xì)胞體積縮小、連接減少、細(xì)胞質(zhì)密度增加、核質(zhì)濃縮、核膜核仁破碎等。當(dāng) PA 濃度為 0.4 mmol/L 時，細(xì)胞數(shù)量急劇減少，細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡或壞死改變，顯示為核固縮、變亮、細(xì)胞減少等現(xiàn)象。Cur-NPs 對高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷有著明顯改善作用，從圖中可以看出，PA 0.2 mmol/L+Cur-NPs 200 μmol/L 組與 PA0.2 mmol/L 組相比，細(xì)胞形態(tài)更加完整。PA0.4 mmol/L+Cur-NPs 200 μmol/L 組與 PA 0.4 mmol/L 組相比，細(xì)胞數(shù)目接近于正常對照組，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核的形態(tài)也接近于正常對照組。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2824473